Влияние гуминового вещества на рост микроскопических грибов

Митюков А.С., Иофина Н.В., Рыбакин В.Н. Влияние гуминового вещества на рост микроскопических грибов // Общество. Среда. Развитие. – 2020, ¹ 3. – С. 90–94.

Общество. Среда. Развитие № 2’2020

Все водные грибы являются гетеротрофными организмами. Они участвуют в минерализации органических субстратов, а уровень заспоренности воды их пропагулами (грибные зародыши гиф и споры различных типов) является показателем трофии водоема. Их интенсивное развитие характерно для водоемов, подвергающихся антропогенному эвтрофи-рованию.

Микопланктон может влиять на активность и развитие других гидробионтов. Пути воздействия могут быть различны- ми: от прямого паразитирования до опосредованного влияния путем выделения биологически активных метаболитов. По сравнению с другими организмами они обладают высокими адаптационными и регенерирующими способностями. Имея мощный ферментативный комплекс, грибы способны нейтрализовать разнообразные токсические элементы [3, с. 37]. Являясь необычайно пластичной, и экологически подвижной группой живых организмов, они участвуют в минерализации органических субстратов.

Установлено, что гуминовые вещества при неблагоприятных воздействиях на биоту оказывают восстанавливающее действие на рост микроскопических грибов, стимулируя их физиологическую активность [1, с. 120–122; 8, c. 14–20].

Гуминовые вещества (ГВ) – тёмноокра-шенные природные высокомолекулярные органические азотсодержащие гетерополимеры арилгликопротеидной природы. Они характеризуются отсутствием постоянного химического состава и молекулярной массы. Эти вещества являются нетоксичными и не обладают аллергенным и мутагенным действием, не накапливаются в живых организмах, не вызывают местного раздражения. Одним из важных свойств ГВ, в том числе соединений меланина, является их биологическая активность. Они осуществляют защитную функцию, повышая устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям, и могут рассматриваться как адаптогены на различные физиологические системы [4, с. 230–246; 5, с. 76–82].

В настоящее время под фульвововыми кислотами (ФК) понимают кислоторастворимую часть ГВ, имеющую характерную окраску (от соломенно желтой до густо оранжевой или даже темно-красной). Чаще всего они включают в себя весь набор кислото-растворимых органических веществ, остающихся в растворе после осаждения ГВ, как вещества с высокой реакционной способностью [12, с. 846–848].

Озерный сапропель является смесью гумусовых систем в состоянии коллапса и ми-крофазного расслоения, а современные методы исследований позволяют с большой долей уверенности перечислить компоненты, входящие в его состав. [11, с 243–250]. В нем присутствуют частицы гуминовых веществ размером 2–4 нм, которые, по-ви-димому, представляют собой фульвокисло-ты (легкорастворимые соединения красновато-жёлтой окраски), а частицы размером 8–12 нм могут являться гуминовыми кислотами (нерастворимые в кислых и растворимые в щелочных растворах соединения тёмной окраски). Гумусовая матрица имеет многоуровневую систему организации: супрамолекулярные элементарные блоки – гуминовые кислоты и фульвокисло-ты – объединены в ассоциаты размером в десятки и сотни нанометров, которые, взаимодействуя между собой, образуют супра-полимерную гумусовую матрицу.

Иными словами, скорость ферментативных реакций при микрофазном расслоении гумусовых матриц изменяется по-разному. Активность одних реакций будет подавляться в большей степени, чем других и, следовательно, условия существования различных микроорганизмов, в том числе цианобактерий и грибов, будут изменяться [13, с. 843–845; 9, с. 552–557].

Исходя из этого, целью данной работы являлось оценить влияние ГВ и ФК на физиологические характеристики дрожжей и водных грибов Ладожского озера.

Материалы и методы

В качестве тест-объекта была выбрана чистая дрожжевая культура Rodotorula rubra Fresen F.C. Harrison.

Помимо эксперимента с чистой дрожжевой культурой были проведены исследования по влиянию гуминовых веществ и фульвокислот сапропеля на озерный планктон. Пробы воды отбирались с поверхности, определялись видовой состав и общая численность микопланктона Ладожского озера. Работы проводились в октябре 2019 года на станции Р2, видовой состав которой типичен для озера.

Для выделения водных грибов был использован метод глубинного посева воды. Объем пробы в опытах был 5 мл, использовалась агаризованная питательная среда Сабуро. С целью задержки роста бактерий к среде добавляли смесь антибиотиков. Опыты проводились в чашках Петри. Засеянные чашки Петри инкубировались в течение двух недель при температуре 18–24 °С, выросшие колонии подсчитывали, а представителей отличающихся колоний отсевали в пробирки со скошенным агаром того же состава [8, с. 13–44]. Видовое определение культур осуществлялось согласно требованиям определителей Lodder [14, с. 35–40] и Пидопличко [6, с. 46–49].

Прорастание спор является первым и важным этапом жизненного цикла грибов и во многом определяет возможность развития популяции. Ростовые характеристики грибов получали путем измерения радиальной скорости роста колоний на агаризованной среде Сабуро в чашках Петри с добавлением ГВ и ФК и без них. Измерения осуществляли каждые 2-е сутки после посева культуры в течение двух недель в зависимости от скорости роста колоний штамма. Эксперимент проводили в 3-кратной повторности. Необходимое нейтральное значения рН растворов уль-традисперсионных гуматосапропелевых суспезий (УДГСС) и фульвовых кислот достигалось добавлением раствора HCl (1:1) для подкисления пробы и 40% раствора NaOH для подщелачивания. Контроль значения рН производился по рН-метру

Среда обитания

Hanna HI 83141 (N). Затем, полученные растворы разбавляли дистиллированной водой из расчета 1:50 и 1:100. Для проведения эксперимента были выбраны, кото- рые вносили в питательную среду в виде стерильных водных растворов.

В работе были использованы воздушно-сухие образцы погребенного сапропеля из месторождения деревня Ермолино Псковской области. Синтез гуминовых веществ осуществлялся способом щелочной экстракции сапропеля по известной методике [6, с. 121–126] и путем ультразвукового облучения смесей на установке ПСБ-ГАЛС 18035-05 (частота 35 кГц, давление 2 Вт/см2, время воздействия от 30 до 90 мин).

Выработанная по описанной методике ультрадисперсная гумато-сапропелевая суспензия (УДГСС) содержала 8,51% органического углерода, 17,02% органических веществ, 12 г/л фосфатов, 0,075 углеводов и витаминов B9 – 0,22 мг/л, и B12 – менее 4 мг/л. Фульвовые кислоты методом кислотной экстракции выделены из полученной ультра дисперсной гумато-сапропеле-вой суспензии.

Результаты и выводы

Как показали исследования, добавление ГВ и ФК в питательную среду неодинаково влияет на ростовые характеристики Rodotorula rubra Fresen F.C. Harrison.

Культура cлабо реагировала на внесение ГВ в разведении 1:100, добавление объема 5 мл гуминового вещества штамм немного менял кинетические характеристики в сторону увеличения (рис. 1). Сти- мулирование этим препаратом при разведении 1:50 приводило к увеличению радиального роста Rodotorula rubra только при объемах 4 и 5 мл (рис. 2).

При добавлении ФК в среду при тех же разведениях, угнетение роста отмечалось при объемах 3 и 4 мл, а увеличение – при объеме 5 мл (табл. 1 и 2).

Таблица 1

Влияние фульвовых кислот (1:100) на радиальный рост Rodotorula rubra (мм)

Время (сутки)	3 мл	4 мл	5 мл	Контроль
2	5,05	5,4	5,8	5,70
4	8,00	8,9	9,5	9,20
6	10,55	11,2	15.0	14,10
8	14,4	15,3	15,9	15,77

Таблица 2

Влияние фульвовых кислот (1:50) на радиальный рост Rodotorula rubra (мм)

Время (сутки)	3 мл	4 мл	5 мл	Контроль
2	4,5	5.0	6.0	5,70
4	7,5	8.0	10.0	9,20
6	10,3	10.9	14.7	14,10
8	14,2	14.9	16.1	15,77

Как отмечалось выше, помимо эксперимента с дрожжевой культурой были про-

Общество. Среда. Развитие № 2’2020

Рис. 1. Влияние гуминового вещества (1:100) на радиальный рост Rodotorula rubra.

Рис. 2. Влияние гуминового вещества (1:50) на радиальный рост Rodotorula rubra.

ведены исследования влияния гуматов на озерный планктон Ладожского озера. Состав водных грибов был представлен: Chy-tridiomycetes, Oomycetes, Zigomycetes , Deuteromy-cetes в соответствии с рис. 3.

Численность водных грибов составляла 1000 диаспор в литре. В основном, все виды реагировали на присутствие ГВ при исследуемых разведениях на объем 5 мл увеличением скорости роста. При добавлении в среду ФК сохранилась та же тенденция, которая наблюдалась в эксперименте со штаммом Rodotorula rubra , то есть, угнетение при объемах 3 и 4 мл и увеличении роста при объеме 5 мл по сравнению с контролем.

При этом, следует выделить реакцию темноокрашенного вида Alternaria alternata (Fr) Keissl. Рост этой колонии под влиянием ГВ затормаживался. Наиболее отчетливо это видно на среде с разведением 1:50 ГB, добавляемого в объеме 5 мл. Значения радиуса колоний Alternaria alternata были на 10,2±3,0% ниже, чем в контроле. При снижении концентрации ГВ 1: 100 рост этой темной пигментированной культуры замедляется на 5,4±1,2%.

Другие темноокрашенные культуры ( Cladosporium cladosporioides, Cladosporium sphaerospermum ) показали меньшую чувствительность к применению гуминового препарата, радиальный рост колоний за-

Chy ridiomycetes

Oomycetes

Zigomycetes

Deuteromycetes

Рис. 3. Встречаемость таксномических групп водных грибов (%) на станции Р2 Ладожского озера.

Среда обитания

медлялся в пределах погрешности. Таким образом, ГВ по-разному влияет на физио- логические характеристики исследуемых штаммов грибов, стимулируя их активность [2, с. 69–76; 7, с. 74; 10, с. 36–40:]. Присутствие гуминового вещества снижа- ло кинетические показатели темноокра-шенных штаммов Alternaria alternatа

Как показали исследования, добавление ГВ и ФК в питательную среду неодинаково влияет на ростовые характеристики Rodotorula rubra Fresen F.C. Harrison.

Культура мало реагировала на внесение ГВ в разведении 1:100, добавление объема 5 мл гуминового вещества штамм менял кинетические характеристики в сторону увеличения. Стимулирование препаратом гуминовых веществ, при разведении 1:50 приводило к увеличению радиального роста Rodotorula rubra только при объемах 4 и 5 мл. При добавлении ФК в среду при тех же разведениях, угнетение роста отмечалось при объемах 3 и 4 мл, а увеличение – при объеме 5 мл.

Все виды водных грибов реагировали на присутствие ГВ при исследуемых разведениях на объем 5 мл увеличением скорости роста. При добавлении в среду ФК сохранилась та же тенденция, которая наблюдалась в эксперименте со штаммом Rodotorula rubra, то есть, угне- тение при объемах 3 и 4 мл и увеличении роста при объеме 5 мл по сравнению с контролем

Рост этой колонии темноокрашенного вида Alternaria alternata (Fr) Keissl под влиянием ГВ затормаживался. Наиболее отчетливо это видно на среде с разведением 1:50 ГB, добавляемого в объеме 5 мл. Значения радиуса колоний Alternaria alternata были на 10,2±3,0% ниже, чем в контроле. При снижении концентрации ГВ 1:100 рост этой темной пигментированной культуры замедляется на 5,4±1,2%. Другие темноокрашенные культуры ( Cladosporium cladosporioides, Cladosporium sphaerospermum ) показали меньшую чувствительность к применению гуминового препарата, радиальный рост колоний замедлялся в пределах погрешности.

Влияние гуминовых веществ оказывает прямое воздействие на рост исследуемых штаммов грибов. Полученные данные наравне с общими представлениями об экологии видов грибов могут быть положены в основу прогнозирования изменений микологического сообщества в условиях значительной токсической нагрузки на водоем.

Общество. Среда. Развитие № 2’2020