Влияние гуминовых веществ пелоидов на процессы свободнорадикального окисления

лекарственных субстанций на основе отечественного природного сырья для производства современных конкурентоспособных фармацевтических препаратов. Перспективными с этой точки зрения являются гуминовые вещества, которые предполагают реализацию терапевтического эффекта на субклеточном и молекулярном уровне. Актуально фармацевтическое использование гуминовых веществ пелоидов, формирующихся в восстановительных условиях при участии сульфатредуцирующих микроорганизмов, что отражается на их структуре и химических свойствах, которые определяют биологическую активность соединений.

Процессы свободнорадикального окисления с участием активных форм кислорода при достаточно низких концентрациях относятся к нормальным метаболическим процессам. Образующиеся радикалы принимают участие в различных биохимических реакциях, протекающих в клетках, что имеет большое значение для обновления состава и поддержании функциональных свойств биологических мембран, энергетических процессов, клеточного деления, синтеза биологически активных веществ, обеспечении защитных функций организма. Свободные радикалы образуются за счет протекания в организме различных биохимических реакций: присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности; микросомальное и митохондриальное окисление, фагоцитоз; ферментативные реакции с участием гидролаз, оксидаз, дегидрогеназ; реакции автоокисления и биосинтеза. При этом неконтролируемые свободнорадикальные реакции, избыточное накопление свободных радикалов могут привести к повреждениям здоровых клеток.

Цель исследования: изучение протекторного действие гуминовых веществ пелоидов на печень в модели острой интоксикации полихлорированными бифенилами.

Объект исследования: фракции гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей (пелоидов): гуминовые (ГК), гиматомелановые (ГМК), фульвовые (ФК) и гумусовые (ГсК) кислоты.

Гистологические исследования проводились на базе института экспериментальной медицины и биотехнологий ГБОУ ВПО «СамГМУ Минздравсоцразвития России». Для гистологического исследования забирали кусочки печени размером 5х5х3 мм из нескольких участков обеих долей органа: под оболочкой, в глубине и в непосредственной близости к воротам печени. Материал фиксировали в 12% нейтральном формалине в течение 1 суток и заливали в гистологическую заливочную среду Histomix® по стандартной методике. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме «Accu-Cut SRM™ 200» («Sakura», USA) и окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон; проводили также ШИК-реакцию по Мак-Манусу. Всего было изготовлено 28 гистологических препаратов. Препараты анализировали и фотографировали с помощью морфологической автоматизированной аналитической системы, включающей микроскоп «Olympus CX 21 FS 1», цифровую фотокамеру «Olympus» С – 4000 ZOOM и системный блок на базе процессора Intel Pentium 4.

Рис. 1. Печень крысы контрольной группы. Центральная зона печеночной дольки, от центральной вены расходятся печеночные балки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

У животных контрольной группы гистологическое изучение срезов тканей показало, что печеночная долька имеет форму шестиугольника, центром которого является центральная вена, от нее радиально расходятся анастомозирующие между собой тяжи печеночных балок, в цитоплазме гепатоцитов находятся включения гликогена, центрально расположенное ядро (рис. 1).

Между балками располагаются синусоидные гемокапилляры, выстланные плоскими эндотелиоцитами, и единичные тканевые макрофаги (звездчатые клетки Купфера); междольковая соединительная ткань в достаточной мере развита в области триад, где она окружает проходящие вместе междольковые желчный проток, вену и артерию.

Гистологическая картина срезов ткани печени экспериментальных животных при однократной интоксикации соволом в дозе 0,1 LD 50 выявила нарушение структуры печени. На третьи сутки эксперимента наблюдается массивная гибель эпителиоцитов, нарушение радиального расположения печеночных балок и разрыв анастомозов между ними, изменена форма и размеры гепатоцитов, часть гепатоцитов лишена ядер, или находится в состоянии гидропической и баллонной дистрофии, отсутствует гликоген в гепатоцитах печеночных долек. На десятые сутки наблюдения вышеописанные изменения сохраняются, кроме того, в центральных зонах печеночных долек формируются очаги некроза, усиливается венозный застой (рис. 2).

Рис. 2. Микрофото гомогената печени крысы при интоксикации соволом в дозе 0,1 LD 50 . Периферическая зона печеночной дольки: резкое расширение синусоидных гемокапилляров, гидропическая дистрофия гепатоцитов, полиморфизм их ядер. 10 сутки наблюдения

В следующей серии экспериментов оценивали гепатопротекторное действие раствора гуминовых кислот. На третьи сутки эксперимента наблюдали уменьшение патологических изменений: синусоиды гемокапилляров умеренно расширены, причем степень расширения уменьшается от центра к периферии, в стенках сосудов и желчных протоков дистрофические изменения носят очаговый характер, большинство гепатоцитов имеют нормальную форму, размеры и структуру. На 10 сутки в клетках обнаруживается гликоген, очаги некроза отсутствуют, структура стенки междольковых артерий и желчных протоков в триадах практически не отличается от структуры ткани печени крыс контрольной группы (рис. 3).

Рис. 3. Микрофото. Лечение крыс ГК, 10 сутки наблюдения. Умеренный застой в междольковой вене. ШИК-реакция по Мак-Манусу. Ув. 400.

При применении гиматомелановых кислот на 3 день эксперимента с интоксикацика-цией крыс соволом в дозе 0,1 LD 50 структура печени восстанавливается мозаично: наблюдаются изменения, характерные для острой интоксикации соволом , так и участки с частичным восстановлением формы и размеров гепатоцитов. На 10 сутки затравки и лечения гиматомелановыми кислотами вышеописанные изменения сохраняются, на периферии печеночных долек встречаются отдельные участки дискомплексации печеночных балок (рис. 4).

Рис. 4. Лечение ГМК, 10 сутки наблюдения. Периферическая зона дольки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

Использование в качестве гепатопротек-тора фульвокислот сохраняет строение печеночных долек во все сроки наблюдения. На 3 сути эксперимента фульвовые кислоты предотвращают резкое расширение синусоидных гемокапилляров, застой в венозных сосудах уменьшается, восстанавливается структура стенки междольковых желчных протоков, выявляются зерна гликогена. На 3 сутки использования гумусовых кислот для купирования окислительного стресса выявили изменения структуры печени, сходные с изменениями во второй группе: резкое расширение синусоидных гемокапилляров, нарушение расположения печеночных балок, разрушение эпителия стенок синусоидов на некоторых участках, обнаружены единичные крупные купферовские клетки. В просвете синусоидов содержится детрит, клетки крови (в основном эритроциты) и отечная жидкость. Набухшие клетки эпителия междольковых желчных протоков, с мутной цитоплазмой и лишенные ядер, застойные венозные сосуды сохраняются в отдельных дольках до 10 дня наблюдения (рис. 5).

Рис. 5. Лечение ФК, 10 сутки наблюдения. Окраска пикрофуксином по Ван Гизон. Ув. 400

Результаты применения гуминовых кислот per os для купирования острой интоксикации печени при затравке соволом в дозе 0,1 LD 50 аналогичны результаты действия этого препарата при внутрибрюшинном введении. На 3 сутки эксперимента структура печеночных клеток сохранена, синусоидные капилляры, как по ширине, так и по структуре практически не отличаются от синусоидов печени контрольной группы крыс. На 10 день лечения гуминовыми кислотами per os в печени сохраняется мозаичность морфологической картины: в отдельных дольках можно видеть гепатоциты в состоянии вакуольной дистрофии, в некоторых клетках отсутствуют ядра, а цитоплазма содержит вакуоли различного размера, в других клетках структура не нарушена.

Выводы и обсуждение. Гуминовые пе-лоидопрепараты обладают способностью восстанавливать окислительно-восстановительный статус организма после воздействия полихлорированных бифенилов до физиологической нормы, при этом антиоксидантная активность возрастает в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые и гиматомелановые кислоты.