Влияние ГВС-111 на уровень экспрессии HIF-зависимого гена VEGFA в условиях гипоксии

Введение: гипоксия индуцибельный фактор 1 (HIF-1) - гетеродимер, состоящий из HIF-1a и HIF-1b субъединиц, и функционирует как фактор транскрипции, регулирующий клеточные реакции в ответ на гипоксию. Хотя обе субъединицы конститутивно экспрессируются, HIF-1a жестко регулируется на уровне белка через опосредованную убиктивин деградацию в нормальных условиях, и стабилизацию и активацию в условиях гипоксии. После стабилизации и активации HIF-1a транслоцирует в ядро, где он димеризуется с HIF-1b, образуя функциональный комплекс HIF-1. В качестве транскрипционного фактора гетеродимер HIF-1 распознает и связывается с консенсусной последовательностью    5'-(A/G)CGTG-3',    называемой    гипоксия- реагирующим элементом (HREs), для активации транскрипционной активности генов-мишеней [1-2]. Идентификация всех генов, регулируемых HIF-1, далека от завершения; однако в настоящее время известные гены HIF-1 могут быть систематизированы по функциям и включают гены, участвующие в анаэробном метаболизме (GLUT), сосудистой регуляции (VEGF), эритропоэзе (EPO) и т.д [3, с. 165].

HIF-1, как известно, стимулирует ангиогенный ответ, активируя транскрипцию генов, кодирующих несколько факторов роста, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). VEGF является ключевым фактором роста и играет существенную роль в развитии ангиогенеза, вазодилатации и уменьшении апоптоза эндотелиальных клеток. Исследования показали ключевую роль генов VEGF в модуляции патологических состояний, таких как диабетическая кардиомиопатия и ишемическое реперфузионное повреждение миокарда. В состав семейства включены 5 генов: VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD и VEGFE [4, с. 80]. Дисфункция сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGFA) может способствовать развитию ряда патологических процессов, характеризующих психотические расстройства. продолжить о дисфункции [5, с. 215].

VEGFA кодирует гепарин связывающий белок, который существует в виде димерного гликопротеина [6, с. 2866]. Этот фактор роста индуцирует пролиферацию и миграцию сосудистых эндотелиальных клеток и имеет важное значение как для физиологического, так и для патологического ангиогенеза. VEGFA активируется во многих известных опухолях, и его экспрессия коррелирует со стадией опухоли. Повышенные уровни этого белка обнаруживаются у пациентов с синдромом ПОЭМС, также известным как синдром Кроу-Фукасе. Аллельные варианты этого гена связаны с микрососудистыми осложнениями диабета 1 (MVCD1) и атеросклерозом [7].

Целью данного исследования является оценка вклада транскрипционного фактора HIF-1 в экспрессию гена-мишени VEGFA в ответ на гипоксию, вызванную химическим миметиком DFO, и под действием пептидного соединения ГВС-111.

Материалы и методы: Все эксперименты проводились на клеточной линии нейробластомы SH-SY-5Y. Для создания гипоксических условий использовался химический миметик гипоксии дефероксамин (DFO). ГВС-111 (Ноопепт) был синтезирован в НИИ фармакологии им В.В.Закусова. Клетки линии SH-SY-5Y в течение 6-10h инкубировали с 100 мкм DFO, для развития в них процессов гипоксии. Затем среду, содержащую DFO, отбирали и добавляли на 4h 100 мкм ГВС-111.

Эксперимент проводился на 6 различных группах: 1 - rest (контроль, клетки росли в течении 10h без добавления веществ), 2 - noo (к клеткам добавляли Ноопепт на 4h), 3 - dfo+норм, с/с (клетки инкубировали 6h с DFO, затем меняли среду и оставляли при нормальных условиях), 4 -dfo+noo, с/с (клетки инкубировали 6h с DFO, меняли среду и добавляли Ноопепт на 4h), 5 - dfo (к клеткам вносили DFO на 10h), 6 - dfo+noo, б/с (к клеткам добавляли DFO на 6h, затем Ноопепт на 4h, не меняя среду).

В качестве housekeeping гена использовался ген HPRT (ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы), который экспрессируется в клетках на постоянном уровне [8, с. 129].

Расчеты проводились относительно показателей гена HPRT в программе REST 2007. Для статистической обработки данных использовалась программа Statistica 6.0.

Результаты: данные представлены в виде медианы, в виде 95% доверительного интервала максимального и минимального значения стандартного отклонения SD. При статистическом анализе достоверных различий между изучаемыми группами не было установлено. На графиках представлены данные медианы с отклонениями минимального и максимального значения (рис.1-2). Из графика 1 можно сделать вывод, что при длительном 10h воздействии DFO количество мРНК VEGFA заметно повышается (рис.1).

контроль Ноо, DFO DFO+Hoo 100 мкМ        100 мкМ

Рис.1. Изменение уровня мРНК VEGFA при длительном воздействии DFO и ГВС-111 (Ноопепт)

В тоже время при совместном добавлении в среду ГВС-111

наблюдается еще большее увеличение мРНК VEGFA в клетке.

100 мкМ

100 мкМ

Рис.2. Изменение уровня мРНК VEGFA при кратковременном воздействии DFO и ГВС-

111 (Ноопепт)

На графике 2 показано, что кратковременное влияние химического миметика гипоксии DFO приводит к увеличению количества мРНК

VEGFA в клетках (рис.2). При совместном воздействии DFO и ГВС-111, наблюдается увеличение количества мРНК VEGFA в клетках нейробластомы. Без воздействия DFO ГВС-111 также приводит к небольшому изменению экспрессии VEGFA.

Обсуждение: таким образом, было установлено, что ГВС-111 сам по себе усиливает экспрессию мРНК гена VEGFA, а также совместно с развитием гипоксии.

Стоит отметить, что самый высокий уровень экспрессии мРНК гена VEGFA наблюдается при воздействии химического миметика гипоксии DFO с последующим добавлением ГВС-111 в течении 10h, что не противоречит полученным данным о наличие у соединения ГВС-111 ранозаживляющего эффекта в условиях гипоксии на клетках HEK293.