Влияние Helicobacter pylori на дифференцировку Т-регуляторных клеток

APC, антитела к FoxP3, меченные PE, все – производства eBioscience, США. Пермеабилизацию мембран, необходимую для мечения FoxP3, производили набором «Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set» (eBioscience, США) согласно инструкциям производителя. Анализ осуществляли на цитофлюориметре FacsCalibur (Beckton Dickinson, США). Для статистической обработки данных использовался критерий Ньюмена–Кейлса.

Результаты и их обсуждение. Данные оценки влияния H. pylori на дифференцировку лимфоцитов в сторону Т-рег при отсутствии в культурах дендритных клеток представлены на рис. 1 и 2. Как можно видеть, добавление H. pylori к культуре Т-клеток приводило к достоверному повышению числа Т-регуляторных CD4+CD25+FoxP3+ клеток через 18 часов совместного культивирования (среднее содержание Т-рег в культурах без стимуляции бактериями составляло 6,01 ± 0,72 % от всех CD4+ клеток, при добавлении H. pylori в соотношении 1:10 содержание Т-рег увеличивалось до 15,04 ± 1,97 %, p <0,01).

Содержание клеток в культурах с соотношением лимфоцитов к бактериям 1:20 и 1:50 также было достоверно выше контрольных значений нестимулированных лимфоцитов (12,7 ± 1,53 % для 1:20 и 10,42 ± 1,97 % для 1:50, отличие от контроля достоверно, p <0,01).

В то же время, как можно видеть, в ряду соотношений наблюдалась тенденция к обратной дозовой зависимости. Соотношение 1:10 показало наибольший прирост содержания Т-рег, который понижался при увеличении числа бактерий в культурах. Однако данная тенденция осталась статистически недостоверной. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии действия H. pylori на отвечающие Т-лимфоциты, не зависимо от присутствия в культуре наиболее профессиональных антигенпрезентирующих клеток – дендритных, и, по нашему мнению, опосредуемых прямым контактом между бактериями и отвечающими Т-лимфоцитами. В то же время в данных условиях эксперимента не исключена роль присутствующих в культурах B-лимфоцитов, также имеющих антигенпрезентирующие свойства. Для исключения их влияния в дальнейшем будут произведены работы с деплецией B-клеток.

Для проверки значимости костимуляции нами были поставлены дополнительные варианты культур с применением не только бактерий,

FoxP3 PE                          CD25 APC                            SSC-H

Рис. 1. H. pylori повышает содержание Т-регуляторных клеток при прямом сокультивировании с лимфоцитами: а – в – данные репрезентативного эксперимента, содержание Т-регуляторных клеток в контрольных культурах без H. pylori ( а – распределение клеток по светорассеиванию, б – выделение CD4+CD25+ клеток, в – выделение FoxP3+ Т-регуляторных клеток, оцениваемая популяция находится в верхнем правом квадранте); г – е – данные репрезентативного эксперимента, содержание Т-регуляторных клеток в культурах, росших в присутствии H. pylori ( г – распределение клеток по светорассеиванию, д – выделение CD4+CD25+ клеток, е – выделение FoxP3+ Т-регуляторных клеток, оцениваемая популяция находится в верхнем правом квадранте). Оцениваемые маркеры и регистрируемые параметры указаны по осям, процентное соотношение клеток – в углах квадрантов

Рис. 2. Влияние H. pylory на дифференцировку Т-регуляторных клеток. Варианты стимуляции обозначены под диаграммой. Контороль – лимфоциты без добавления бактерий и антител;

* достоверные отличия от контрольной культуры, p <0,01

но и стимулирующих антител к CD3 и CD28, предоставляющих Т-клеткам сигнал, подобный стимуляции от АПК. Данные анализа культур с добавлением антител также приведены на рис. 2. Как можно видеть, стимуляция антителами сразу приводила к появлению в культуре достаточно высоких уровней содержания Т-рег (14,0 ± 1,29 % Т-рег для культур с добавлением только CD3 без H. pylori, 16,54 ± 2,13 % для культур с добавлением смеси CD3 и CD28 – модель более полной стимуляции, опять же без добавления H. pylori ). Введение в культуры H. pylori не приводило к увеличению содержания Т-рег (для культур с CD3 содержание Т-рег составляло 11,25 ± 1,06 % для соотношения 1:10, 10,04 ± 1,14 – для соотношения 1:20, 10,28 ± 1,54 % – для соотношения 1:50, достоверных отличий от культуры с CD3 без H. pylori нет; для культур со смесью CD3 и CD28 содержание Т-рег 16,93 ± 3,74 % для соотношения 1:10, 13,95 ± 2,13 % – для соотношения 1:20, 12,82 ± ± 1,28 % – для соотношения 1:50, достоверных отличий от культуры со смесью CD3+CD28 без H. pylori нет). Как и в случае с культурами, стимулированными только H. pylori , наблюдалась тенденция к обратной дозовой зависимости между дозой микроба в культуре и содержанием Т-рег.

Все значения содержания Т-рег в культурах с CD3 и CD3+CD28 достоверно отличались от содержания Т-рег в культурах лимфоцитов без антител и H. pylori (p<0,01) и не отличались от культур, стимулированных H. pylori без антител. Таким образом, H. pylori стимулирует дифференцировку лимфоцитов в сторону Т-рег на уровне активации антителами. Отсутствие повышения числа Т-рег в культурах, стимулированных одновременно H. pylori и антителами, по-видимому, объясняется поликлональным характером активирующего действия антител, которые вызвали дифференцировку всех CD4+ Т-клеток, исходно имевших коммитирование к развитию в сторону Т-рег.

Для проверки специфичности действия H. pylori нами применялись культуры лимфоцитов, стимулированные другим микроорганизмом, обитающим в желудочно-кишечном тракте человека – Escherichia coli (E.coli).

Используемые нами культуры лимфоцитов и E. coli росли как в отсутствии, так и в присутствии антител к CD3 и CD28. Соотношение лимфоцитов и E. coli составляло 1:50. Как можно видеть из рис. 1, E. coli не вызывала созревания Т-рег в культурах и препятствовала стимулирующему действию антител. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что стимулирующее дифференцировку Т-рег влияние является свойством именно H. pylori и, по всей видимости, не опосредуется паттернами патогенов (сходными у H. pylori и E.coli – подвижных грамотрицательных микроорганизмов).

Выводы. Оценка способности микроорганизмов модулировать иммунный ответ, в особенности, если подобное модулирование способствует выживанию микроорганизма во внутренней среде хозяина, является актуальной фундаментальной и практической задачей. Понимание данных механизмов, несомненно, может способствовать как прогнозированию возможных рисков, обусловленных микроорганизмом, так и повышению эффективности терапевтических подходов к патологиям, обусловленным данным микроорганизмом. В представленной работе нами показана способность H. pylori оказывать дифференцировочное действие на Т-лимфоциты, направляющее их развитие в сторону Т-регуляторных клеток. При отсутствии в культурах дендритных клеток – популяции иммуно-цитов, процесс, по современным данным, имеет наиболее выраженную способность управлять течением иммунного ответа. В пределах исследуемой группы данное действие наблюдалось при соотношениях микробов и Т-клеток от 1:10 до 1:50, не требовало присутствия в куль- турах АПК или стимулирующих антител. В среднем рост процентного содержания Т-регулятор-ных CD4+CD25+FoxP3+ клеток среди CD4+лим-фоцитов составлял 2,12 раза. По всей видимости, в условиях данного эксперимента воздействие H. pylori затрагивало клетки, исходно коммитированные к развитию в сторону Т-рег, так как поликлональная стимуляция антителами к CD28 и/или CD3 «поглощала» эффект от введения бактерий – культуры, стимулированные только антителами, а также антителами одновременно с H. pylori, статистически не отличались по содержанию Т-рег. Дифференцирующее действие, по всей видимости, являлось специфическим свойством именно H. pylori, так как стимуляция лимфоцитов с помощью другого микроорганизма, способного длительно выживать в условиях ЖКТ – E. coli – не вызывала повышения содержания Т-регуляторных клеток. Таким образом, нами была принципиально продемонстрирована способность H. pylori оказывать влияние на дифференцировку регуляторных Т-клеток, не опосредуемая презентацией микробных антигенов дендритными клетками, но, по всей видимости, зависящая именно от прямого воздействия микроба на Т-клетки. Понимание данного механизма может позволить выделить действующее начало, индуцирующее развитие Т-рег и, таким образом, потенциально являющееся естественным толерогенным фактором, применимым в качестве лекарственного средства.