Влияние холодовой обработки на культуру пыльников гибрида риса in vitro
Автор: Илюшко М.В.
Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau
Рубрика: Сельскохозяйственные науки: Агрономия
Статья в выпуске: 4, 2015 года.
Бесплатный доступ
Изучено влияние двух режимов холодовой обработки пыльников (5°С и 10°С в течение семи дней) для культуры in vitro дальневосточных гибридов риса Oryza sativa L подвида japonica. Каллусообразование оказалось одинаковым при обоих режимах. Обработка пыльников температурой 5°С значительно эффективнее за счет более высокого выхода зеленых побегов на каллус (t=2,45; p=0,04) и меньшего альбинизма (t=2,69; p=0,02).
Рис, культура пыльников, холодовая обработка, регенерант
Короткий адрес: https://sciup.org/14084209
IDR: 14084209 | УДК: 633.18:631.527.8:581.143.6
Текст научной статьи Влияние холодовой обработки на культуру пыльников гибрида риса in vitro
Культура пыльников широко используется в селекционных программах риса во всем мире [3–7] и в нашей стране, позволяя сократить селекционный процесс на 5–6 лет [8]. Методы биотехнологии используются для создания исходного селекционного материала в Приморском крае почти 30 лет [1, 9, 10]. К сожалению, в Государственном реестре селекционных достижений РФ по 12-й зоне пока отсутствуют «биотехнологические» сорта риса [11, ].
В Приморском НИИСХ впервые начаты исследования по созданию исходного материала для селекции риса методом культуры пыльников in vitro . Методики получения регенерантов риса андроклинного происхождения отражены в ряде работ [8]. Однако любое начинание требует отработки методики и оптимизации условий для применяемых генотипов. Критическими в получении регенерантов риса в культуре пыльников являются ряд факторов: генотип исходных растений, условия выращивания исходных растений, состав индукционных питательных сред, температура предобработки пыльников и др. [5–8].
Изучение влияния последнего фактора стало предметом данного исследования. Известно, что холодовая обработка пыльников значительно увеличивает как индукцию каллусов, так и выход зеленых растений у риса [12]. Для сортов риса подвида japonica наиболее эффективна температура 5°С в течение семи дней [12]. Дальневосточные исследователи рекомендуют температуру 8–12° С в течение 7–12 дней [9, 13].
Цель исследования . Подобрать эффективный режим холодовой обработки пыльников дальневосточных гибридов риса, используемых в селекционном процессе, для культуры in vitro .
Материалы и методы . В качестве исходного материала использовано потомство четырех гибридов второго поколения риса посевного Oryza sativa L. подвида japonica . Родительскими формами являлись сорта отечественной, в том числе дальневосточной, и японской селекции: 1-2 ((Рассвет х Новатор) х Новатор); 2-1 (Новатор х (Приозерный х (Дальневосточный х Hayakaze))); 7-1 (Хазар х Дарий 23); 13-3 (Луговой х Вираж).
Растения-доноры выращивали на вегетационной площадке лаборатории селекции риса до периода сбора метелок.
Холодовая обработка и выделение пыльников проводились согласно методике, опубликованной в работах М.В. Илюшко [14, 15]. Режим обработки пыльников 5 и 10°С в течение семи дней.
Получение регенерантов проводилось в два этапа. На первом этапе в культуре пыльников индуцировали пролиферацию каллуса. Для этого использованы восемь вариантов индукционных сред, состав которых представлен в таблице 1. Второй этап заключался непосредственно в получении растений-регенерантов, для чего каллусы пересаживали на регенерационную среду N 6 , состав среды и условия культивирования пыльников и каллусов приведены в работах [14, 15].
Для укоренения регенерантов использована среда Т. Murashige, F.Skoog [17] с половинным минеральным составом макросолей, в вариации, приведенной Ю.К. Гончаровой [12].
Регенеранты с развитой корневой системой высаживали в горшечную культуру и продолжали выращивать в условиях культуральной комнаты до образования семян.
Математическую обработку данных проводили в программе Statistica, разницу между вариантами определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
Состав питательных индукционных сред, мг/л
Таблица 1
|
Компонент |
N 6 -1 |
N 6 -2 |
N 6 -3 |
MS-и |
Mix-1 |
Mix-2 |
M 8 -пр |
N 6 -пр |
|
Макросоли |
N 6 * |
N 6 |
N 6 |
MS** |
N6 |
N 6 |
M 8 *** |
N 6 |
|
Микросоли |
N 6 |
N 6 |
N 6 |
MS |
MS |
MS |
M 8 |
N 6 |
|
Железо-хелат |
N 6 |
N 6 |
N 6 |
MS |
MS |
MS |
M 8 |
N 6 |
|
Тиамин HCl – В 1 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
5,0 |
1,0 |
|
Пиридоксин HCl – В 6 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
2,5 |
0,5 |
|
Никотиновая кислота – PP |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
3,0 |
0,5 |
|
Глицин |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
10,0 |
2,0 |
|
Аланин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
10,0 |
– |
|
Мезо-инозитол |
– |
– |
– |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
– |
– |
|
Казеин гидролизат |
– |
– |
– |
– |
– |
500,0 |
– |
– |
|
L-глутамин |
– |
– |
– |
– |
– |
500,0 |
– |
– |
|
ФУК |
– |
– |
– |
– |
– |
15,0 |
10,0 |
10,0 |
|
2,4-Д |
2,0 |
1,0 |
0,5 |
2,0 |
2,0 |
– |
– |
– |
|
НУК |
– |
– |
1,0 |
– |
– |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
|
Кинетин |
– |
0,2 |
0,2 |
– |
– |
– |
– |
– |
|
БАП |
– |
– |
– |
– |
– |
0,5 |
– |
– |
|
AgNO 3 |
– |
– |
– |
– |
– |
7,5 |
– |
– |
|
Мальтоза, г/л |
– |
– |
– |
– |
– |
54,0 |
– |
– |
|
Сахароза, г/л |
30,0 |
40,0 |
40,0 |
30,0 |
30,0 |
– |
30,0 |
30,0 |
|
Агар, г/л |
8,0 |
9,0 |
9,0 |
8,0 |
8,0 |
8,0 |
8,0 |
8,0 |
|
рН |
5,8 |
5,8 |
5,8 |
5,8 |
5,8 |
5,8 |
5,8 |
5,8 |
Примечание. * – среда C. Chu [16]; ** – среда T. Murashige and F. Skoog [17]; *** – среда по прописи, приведенной в работе [8].
Результаты . Пыльники были введены в культуру in vitro в 2013 году в количестве 4030 штук. В каждом варианте на питательные среды инокулировано от 20 до 128 эксплантов.
После холодовой обработки пыльников 5°С каллусообразование на разных вариантах сред составило от 0 до 38,8 % (табл. 2), в среднем – 8,43 %. После холодовой обработки 10°С каллусообразование было выше – от 0 до 40,0 % (табл. 3), в среднем 11,02 %. Статистически значимых различий не обнаружено (t=1,09; p=0,28), т.е. процесс каллусообразования происходит одинаково как при холодовой обработке 5°С, так и при 10°С.
Каллусообразование пыльников риса, прошедших холодовую обработку 5°С, %
Таблица 2
|
Гибрид |
Вариант индукционной среды |
|||||||
|
N 6 -1 |
N 6 -2 |
N 6 -3 |
MS-и |
Mix-1 |
Mix-2 |
M 8 -пр |
N 6 -пр |
|
|
1-2 |
16,2 |
3,9 |
6,4 |
0 |
7,8 |
0 |
2,9 |
2,6 |
|
2-1 |
3,7 |
0 |
0 |
6,0 |
5,2 |
0 |
12,1 |
1,7 |
|
7-1 |
3,4 |
11,5 |
13,2 |
7,8 |
38,8 |
2,5 |
19,1 |
12,5 |
|
13-3 |
14,5 |
11,6 |
9,5 |
12,0 |
22,1 |
2,5 |
10,7 |
9,6 |
|
_ X |
9,5 |
6,8 |
7,2 |
6,5 |
18,5 |
1,3 |
11,2 |
6,6 |
Таблица 3
|
Гибрид |
Вариант индукционной среды |
|||||||
|
N 6 -1 |
N 6 -2 |
N 6 -3 |
MS-и |
Mix-1 |
Mix-2 |
M 8 -пр |
N 6 -пр |
|
|
1-2 |
5,0 |
8,8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
7,5 |
|
2-1 |
3,7 |
0 |
8,8 |
0 |
3,7 |
0 |
17,5 |
9,4 |
|
7-1 |
22,0 |
10,0 |
12,5 |
25,0 |
25,0 |
13,2 |
26,3 |
15,0 |
|
13-3 |
28,9 |
11,0 |
40,0 |
10,2 |
30,0 |
5,0 |
4,0 |
10,0 |
|
_ X |
14,9 |
7,5 |
15,3 |
8,8 |
14,7 |
4,6 |
12,0 |
10,5 |
Каллусообразование пыльников риса, прошедших холодовую обработку 10°С, %
Каллусные агрегаты, полученные на индукционных средах, были пересажены на среду N 6 для регенерации. После холодовой обработки пыльников температурой 5°С в среднем 57,0 % каллусов образовали побеги (табл. 4). При применении 10°С средний процент каллусов с побегами был несколько ниже – 46,3 %, различия недостоверны (t=1,06; p=0,31).
Число зеленых побегов на каллус, при использовании температуры 5°С, составило в среднем 3,86 шт., а при 10°С этот показатель в среднем был 3,05 шт. Различия также статистически недостоверны (t=0,83; p=0,42). С устранением из расчетов данных, полученных на средах Mix-2 и M 8 -пр, разница по числу зеленых побегов на каллус становится достоверной. При холодовой обработке пыльников 5°С среднее число зеленых побегов на каллус ̅ =5,08, а при обработке 10°С ̅ =3,21, что значительно ниже (t=2,45; p=0,04). Данные, полученные на среде Mix-2, удалили из расчета, поскольку на этой среде получен очень низкий процент каллусообразования (табл. 2 и 3), и только 1 и 2 каллуса с побегами (табл. 4). На среде M 8 -пр образовалось очень небольшое количество зеленых побегов в сравнении с альбиносами, что объясняется высоким содержанием железа в составе питательной среды. Избыток Fe+ ионов является одним их факторов повышения альбинизма [8].
Соотношение зеленых побегов и альбиносов при использовании температуры 5°С в два раза выше (1,12), чем при температуре 10°С (табл. 4), различия недостоверны. При удалении данных, полученных на среде Mix-2, соотношение при температуре 5°С ̅ =1,28, а при температуре 10°С ̅ =0,63, различия статистически значимы (t=2,69; p=0,02). Это означает, что в первом случае больше образуется зеленых побегов, а во втором случае – альбиносов.
Влияние холодовой обработки пыльников на регенерацию побегов из каллуса
Таблица 4
|
Вариант индукционной среды |
Холодовая обработка 5° С |
Холодовая обработка 10° С |
||||||
|
Число каллусов с побегами |
Процент каллусов с побегами |
Число зеленых побегов на каллус |
Соотношение зеленых побегов/ альбиносов |
Число каллусов с побегами |
Процент каллусов с побегами |
Число зеленых побегов на каллус |
Соотношение зеленых побегов/ альбиносов |
|
|
N 6 -1 |
26 |
78,8 |
4,54 |
1,49 |
25 |
58,1 |
4,28 |
0,92 |
|
N 6 -2 |
22 |
84,6 |
4,73 |
1,86 |
8 |
40,0 |
1,00 |
0,27 |
|
N 6 -3 |
24 |
92,3 |
5,92 |
1,63 |
21 |
60,0 |
4,76 |
0,58 |
|
MS-и |
15 |
51,7 |
3,07 |
1,00 |
11 |
52,4 |
2,82 |
0,55 |
|
Mix-1 |
32 |
45,1 |
5,22 |
1,39 |
21 |
53,9 |
3,00 |
0,96 |
|
Mix-2 |
1 |
50,0 |
0 |
- |
2 |
33,3 |
3,00 |
0,60 |
|
M 8 -пр |
7 |
31,8 |
0,43 |
0,08 |
9 |
47,4 |
2,11 |
0,39 |
|
N 6 -пр |
3 |
21,4 |
7,00 |
1,50 |
5 |
25,0 |
3,40 |
0,71 |
|
_ X |
57,0 |
3,86 |
1,12 |
46,3 |
3,05 |
0,62 |
||
Выводы. Таким образом, для дальневосточных гибридов холодовая обработка пыльников температурой 5°С значительно эффективнее за счет более высокого выхода зеленых побегов на каллус и меньшего альбинизма.
Практическим результатом данной работы стало получение регенерантных линий риса и их семян, которые переданы в селекционный питомник лаборатории селекции риса Приморского НИИСХ.
Список литературы Влияние холодовой обработки на культуру пыльников гибрида риса in vitro
- Ковалевская В.А. Селекция риса в Дальневосточной зоне рисосеяния//Достижения науки и техники АПК. -2008. -№ 6. -С. 8-10.
- Холупенко И.П., Бурундукова О.Л. Модели интенсивных сортов риса для условий Дальневосточной зоны рисосеяния//Вестник КрасГАУ. -2013. -№ 12. -С. 96-100.
- Гончарова Ю.К. Использование культуры пыльников в селекции риса в Китае: обзор//Рисоводство. -2005. -№ 7. -С. 8-12.
- Костылев П.И. Биотехнология и оценочный этап селекции риса: обзор//Зерновое хозяйство России. -2009. -№ 1. -С. 25-30.
- Datta S.K. Androgenic haploids: factors controlling development and its application in crop improvement//Current Science. -2005. -Vol. 10. -P. 1870-1878.
- Dunwell J.M. Haploids in flowering plants: origin and exploitation//Plant Biotechnology Journal. -2010. -№ 8. -P. 377-424.
- Germana M.A. Anther culture for haploid and doubled haploid production//Plant Cell. Tiss. Organ. Cult. -2011. -Vol. 104. -P. 283-300.
- Гончарова Ю.К. Использование метода культуры пыльников в селекции риса. -Краснодар: Изд-во ВНИИ риса, 2012. -91 с.
- Змеева В.Н. Тенденции изменчивости некоторых хозяйственно полезных признаков в популяции со-маклонов и андрогенных дигаплоидов риса Oryza sativa L.: автореф. дис.. канд. биол. наук: 03.00.12. -Владивосток, 1995. -27 с.
- Змеева В.Н., Журавлев Ю.Н. Использование методов биотехнологии в селекции риса в Приморском крае//Научное обеспечение АПК Дальнего Востока: мат-лы науч. сессии (Уссурийск, 18-20 августа 1993 г.). -Новосибирск, 1995. -С. 132-136.
- Сорта риса селекции ГНУ «Приморский НИИСХ Россельхозакадемии». -Тимирязевский, 2012. -10 с.
- Гончарова Ю.К. Использование культуры пыльников в селекции риса. -Краснодар, 2007. -56 с.
- Журавлев Ю.Н. Отчет по гранту ДВО РАН за 2006 г. «Методы биотехнологии в селекции сои и риса». -Владивосток, 2006. -9 с.
- Илюшко М.В. Применение феноксиуксусной кислоты в культуре пыльников риса in vitro//Вестник КрасГАУ. -2014. -№ 6. -С.143-148.
- Ilyushko M.V. Ehe effect of auxin on plant regeneration on rice from anther culture in vitro//Science Time. -2014. -№ 10 -P. 160-167.
- Chu C. The N6 medium and its applications to anther culture of cereal crops//Plant Tissue Culture. -1978. -P. 43-50.
- Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures//Physiol. Plant. -1962. -Vol. 15. -P. 473-497.
