Влияние холодовой обработки на культуру пыльников гибрида риса in vitro

Бесплатный доступ

Изучено влияние двух режимов холодовой обработки пыльников (5°С и 10°С в течение семи дней) для культуры in vitro дальневосточных гибридов риса Oryza sativa L подвида japonica. Каллусообразование оказалось одинаковым при обоих режимах. Обработка пыльников температурой 5°С значительно эффективнее за счет более высокого выхода зеленых побегов на каллус (t=2,45; p=0,04) и меньшего альбинизма (t=2,69; p=0,02).

Рис, культура пыльников, холодовая обработка, регенерант

Короткий адрес: https://sciup.org/14084209

IDR: 14084209

Текст научной статьи Влияние холодовой обработки на культуру пыльников гибрида риса in vitro

Культура пыльников широко используется в селекционных программах риса во всем мире [3–7] и в нашей стране, позволяя сократить селекционный процесс на 5–6 лет [8]. Методы биотехнологии используются для создания исходного селекционного материала в Приморском крае почти 30 лет [1, 9, 10]. К сожалению, в Государственном реестре селекционных достижений РФ по 12-й зоне пока отсутствуют «биотехнологические» сорта риса [11, ].

В Приморском НИИСХ впервые начаты исследования по созданию исходного материала для селекции риса методом культуры пыльников in vitro . Методики получения регенерантов риса андроклинного происхождения отражены в ряде работ [8]. Однако любое начинание требует отработки методики и оптимизации условий для применяемых генотипов. Критическими в получении регенерантов риса в культуре пыльников являются ряд факторов: генотип исходных растений, условия выращивания исходных растений, состав индукционных питательных сред, температура предобработки пыльников и др. [5–8].

Изучение влияния последнего фактора стало предметом данного исследования. Известно, что холодовая обработка пыльников значительно увеличивает как индукцию каллусов, так и выход зеленых растений у риса [12]. Для сортов риса подвида japonica наиболее эффективна температура 5°С в течение семи дней [12]. Дальневосточные исследователи рекомендуют температуру 8–12° С в течение 7–12 дней [9, 13].

Цель исследования . Подобрать эффективный режим холодовой обработки пыльников дальневосточных гибридов риса, используемых в селекционном процессе, для культуры in vitro .

Материалы и методы . В качестве исходного материала использовано потомство четырех гибридов второго поколения риса посевного Oryza sativa L. подвида japonica . Родительскими формами являлись сорта отечественной, в том числе дальневосточной, и японской селекции: 1-2 ((Рассвет х Новатор) х Новатор); 2-1 (Новатор х (Приозерный х (Дальневосточный х Hayakaze))); 7-1 (Хазар х Дарий 23); 13-3 (Луговой х Вираж).

Растения-доноры выращивали на вегетационной площадке лаборатории селекции риса до периода сбора метелок.

Холодовая обработка и выделение пыльников проводились согласно методике, опубликованной в работах М.В. Илюшко [14, 15]. Режим обработки пыльников 5 и 10°С в течение семи дней.

Получение регенерантов проводилось в два этапа. На первом этапе в культуре пыльников индуцировали пролиферацию каллуса. Для этого использованы восемь вариантов индукционных сред, состав которых представлен в таблице 1. Второй этап заключался непосредственно в получении растений-регенерантов, для чего каллусы пересаживали на регенерационную среду N 6 , состав среды и условия культивирования пыльников и каллусов приведены в работах [14, 15].

Для укоренения регенерантов использована среда Т. Murashige, F.Skoog [17] с половинным минеральным составом макросолей, в вариации, приведенной Ю.К. Гончаровой [12].

Регенеранты с развитой корневой системой высаживали в горшечную культуру и продолжали выращивать в условиях культуральной комнаты до образования семян.

Математическую обработку данных проводили в программе Statistica, разницу между вариантами определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Состав питательных индукционных сред, мг/л

Таблица 1

Компонент

N 6 -1

N 6 -2

N 6 -3

MS-и

Mix-1

Mix-2

M 8 -пр

N 6 -пр

Макросоли

N 6 *

N 6

N 6

MS**

N6

N 6

M 8 ***

N 6

Микросоли

N 6

N 6

N 6

MS

MS

MS

M 8

N 6

Железо-хелат

N 6

N 6

N 6

MS

MS

MS

M 8

N 6

Тиамин HCl – В 1

1,0

1,0

1,0

0,4

0,4

0,4

5,0

1,0

Пиридоксин HCl – В 6

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

2,5

0,5

Никотиновая кислота – PP

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

3,0

0,5

Глицин

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

10,0

2,0

Аланин

10,0

Мезо-инозитол

100,0

100,0

100,0

Казеин гидролизат

500,0

L-глутамин

500,0

ФУК

15,0

10,0

10,0

2,4-Д

2,0

1,0

0,5

2,0

2,0

НУК

1,0

2,0

2,0

2,0

Кинетин

0,2

0,2

БАП

0,5

AgNO 3

7,5

Мальтоза, г/л

54,0

Сахароза, г/л

30,0

40,0

40,0

30,0

30,0

30,0

30,0

Агар, г/л

8,0

9,0

9,0

8,0

8,0

8,0

8,0

8,0

рН

5,8

5,8

5,8

5,8

5,8

5,8

5,8

5,8

Примечание. * – среда C. Chu [16]; ** – среда T. Murashige and F. Skoog [17]; *** – среда по прописи, приведенной в работе [8].

Результаты . Пыльники были введены в культуру in vitro в 2013 году в количестве 4030 штук. В каждом варианте на питательные среды инокулировано от 20 до 128 эксплантов.

После холодовой обработки пыльников 5°С каллусообразование на разных вариантах сред составило от 0 до 38,8 % (табл. 2), в среднем – 8,43 %. После холодовой обработки 10°С каллусообразование было выше – от 0 до 40,0 % (табл. 3), в среднем 11,02 %. Статистически значимых различий не обнаружено (t=1,09; p=0,28), т.е. процесс каллусообразования происходит одинаково как при холодовой обработке 5°С, так и при 10°С.

Каллусообразование пыльников риса, прошедших холодовую обработку 5°С, %

Таблица 2

Гибрид

Вариант индукционной среды

N 6 -1

N 6 -2

N 6 -3

MS-и

Mix-1

Mix-2

M 8 -пр

N 6 -пр

1-2

16,2

3,9

6,4

0

7,8

0

2,9

2,6

2-1

3,7

0

0

6,0

5,2

0

12,1

1,7

7-1

3,4

11,5

13,2

7,8

38,8

2,5

19,1

12,5

13-3

14,5

11,6

9,5

12,0

22,1

2,5

10,7

9,6

_

X

9,5

6,8

7,2

6,5

18,5

1,3

11,2

6,6

Таблица 3

Гибрид

Вариант индукционной среды

N 6 -1

N 6 -2

N 6 -3

MS-и

Mix-1

Mix-2

M 8 -пр

N 6 -пр

1-2

5,0

8,8

0

0

0

0

0

7,5

2-1

3,7

0

8,8

0

3,7

0

17,5

9,4

7-1

22,0

10,0

12,5

25,0

25,0

13,2

26,3

15,0

13-3

28,9

11,0

40,0

10,2

30,0

5,0

4,0

10,0

_

X

14,9

7,5

15,3

8,8

14,7

4,6

12,0

10,5

Каллусообразование пыльников риса, прошедших холодовую обработку 10°С, %

Каллусные агрегаты, полученные на индукционных средах, были пересажены на среду N 6 для регенерации. После холодовой обработки пыльников температурой 5°С в среднем 57,0 % каллусов образовали побеги (табл. 4). При применении 10°С средний процент каллусов с побегами был несколько ниже – 46,3 %, различия недостоверны (t=1,06; p=0,31).

Число зеленых побегов на каллус, при использовании температуры 5°С, составило в среднем 3,86 шт., а при 10°С этот показатель в среднем был 3,05 шт. Различия также статистически недостоверны (t=0,83; p=0,42). С устранением из расчетов данных, полученных на средах Mix-2 и M 8 -пр, разница по числу зеленых побегов на каллус становится достоверной. При холодовой обработке пыльников 5°С среднее число зеленых побегов на каллус ̅ =5,08, а при обработке 10°С ̅ =3,21, что значительно ниже (t=2,45; p=0,04). Данные, полученные на среде Mix-2, удалили из расчета, поскольку на этой среде получен очень низкий процент каллусообразования (табл. 2 и 3), и только 1 и 2 каллуса с побегами (табл. 4). На среде M 8 -пр образовалось очень небольшое количество зеленых побегов в сравнении с альбиносами, что объясняется высоким содержанием железа в составе питательной среды. Избыток Fe+ ионов является одним их факторов повышения альбинизма [8].

Соотношение зеленых побегов и альбиносов при использовании температуры 5°С в два раза выше (1,12), чем при температуре 10°С (табл. 4), различия недостоверны. При удалении данных, полученных на среде Mix-2, соотношение при температуре 5°С ̅ =1,28, а при температуре 10°С ̅ =0,63, различия статистически значимы (t=2,69; p=0,02). Это означает, что в первом случае больше образуется зеленых побегов, а во втором случае – альбиносов.

Влияние холодовой обработки пыльников на регенерацию побегов из каллуса

Таблица 4

Вариант индукционной среды

Холодовая обработка 5° С

Холодовая обработка 10° С

Число каллусов с побегами

Процент каллусов с побегами

Число зеленых побегов на каллус

Соотношение зеленых побегов/ альбиносов

Число каллусов с побегами

Процент каллусов с побегами

Число зеленых побегов на каллус

Соотношение зеленых побегов/ альбиносов

N 6 -1

26

78,8

4,54

1,49

25

58,1

4,28

0,92

N 6 -2

22

84,6

4,73

1,86

8

40,0

1,00

0,27

N 6 -3

24

92,3

5,92

1,63

21

60,0

4,76

0,58

MS-и

15

51,7

3,07

1,00

11

52,4

2,82

0,55

Mix-1

32

45,1

5,22

1,39

21

53,9

3,00

0,96

Mix-2

1

50,0

0

-

2

33,3

3,00

0,60

M 8 -пр

7

31,8

0,43

0,08

9

47,4

2,11

0,39

N 6 -пр

3

21,4

7,00

1,50

5

25,0

3,40

0,71

_

X

57,0

3,86

1,12

46,3

3,05

0,62

Выводы. Таким образом, для дальневосточных гибридов холодовая обработка пыльников температурой 5°С значительно эффективнее за счет более высокого выхода зеленых побегов на каллус и меньшего альбинизма.

Практическим результатом данной работы стало получение регенерантных линий риса и их семян, которые переданы в селекционный питомник лаборатории селекции риса Приморского НИИСХ.

Список литературы Влияние холодовой обработки на культуру пыльников гибрида риса in vitro

  • Ковалевская В.А. Селекция риса в Дальневосточной зоне рисосеяния//Достижения науки и техники АПК. -2008. -№ 6. -С. 8-10.
  • Холупенко И.П., Бурундукова О.Л. Модели интенсивных сортов риса для условий Дальневосточной зоны рисосеяния//Вестник КрасГАУ. -2013. -№ 12. -С. 96-100.
  • Гончарова Ю.К. Использование культуры пыльников в селекции риса в Китае: обзор//Рисоводство. -2005. -№ 7. -С. 8-12.
  • Костылев П.И. Биотехнология и оценочный этап селекции риса: обзор//Зерновое хозяйство России. -2009. -№ 1. -С. 25-30.
  • Datta S.K. Androgenic haploids: factors controlling development and its application in crop improvement//Current Science. -2005. -Vol. 10. -P. 1870-1878.
  • Dunwell J.M. Haploids in flowering plants: origin and exploitation//Plant Biotechnology Journal. -2010. -№ 8. -P. 377-424.
  • Germana M.A. Anther culture for haploid and doubled haploid production//Plant Cell. Tiss. Organ. Cult. -2011. -Vol. 104. -P. 283-300.
  • Гончарова Ю.К. Использование метода культуры пыльников в селекции риса. -Краснодар: Изд-во ВНИИ риса, 2012. -91 с.
  • Змеева В.Н. Тенденции изменчивости некоторых хозяйственно полезных признаков в популяции со-маклонов и андрогенных дигаплоидов риса Oryza sativa L.: автореф. дис.. канд. биол. наук: 03.00.12. -Владивосток, 1995. -27 с.
  • Змеева В.Н., Журавлев Ю.Н. Использование методов биотехнологии в селекции риса в Приморском крае//Научное обеспечение АПК Дальнего Востока: мат-лы науч. сессии (Уссурийск, 18-20 августа 1993 г.). -Новосибирск, 1995. -С. 132-136.
  • Сорта риса селекции ГНУ «Приморский НИИСХ Россельхозакадемии». -Тимирязевский, 2012. -10 с.
  • Гончарова Ю.К. Использование культуры пыльников в селекции риса. -Краснодар, 2007. -56 с.
  • Журавлев Ю.Н. Отчет по гранту ДВО РАН за 2006 г. «Методы биотехнологии в селекции сои и риса». -Владивосток, 2006. -9 с.
  • Илюшко М.В. Применение феноксиуксусной кислоты в культуре пыльников риса in vitro//Вестник КрасГАУ. -2014. -№ 6. -С.143-148.
  • Ilyushko M.V. Ehe effect of auxin on plant regeneration on rice from anther culture in vitro//Science Time. -2014. -№ 10 -P. 160-167.
  • Chu C. The N6 medium and its applications to anther culture of cereal crops//Plant Tissue Culture. -1978. -P. 43-50.
  • Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures//Physiol. Plant. -1962. -Vol. 15. -P. 473-497.
Еще
Статья научная