Влияние хорионического гонадотропина на фагоцитарную активность эозинофилов периферической крови женщин. Роль Са2+-акцептирующих белков

Введение '

Одна из функций эозинофилов - обеспечение противогельминтного иммунитета, при этом ключевым моментом их активации является дегрануляция (Giembycz, Lindsay, 1999). Эозинофилы также могут функционировать как антигенпрезентирующие клетки, модулируя иммунный ответ в сторону ТН2-типа (Shi, 2004). Известна также способность этих клеток фагоцитировать патогены благодаря экспрессии С1- ,СЗ- и С4-рецепторов комплемента (Giembycz, Lindsay, 1999). На поверхности большей части эозинофилов экспрессируется FCy-рецептор (Beeken et al., 1987), а также Fc^g,^-рецепторы (Giembycz, Lindsay, 1999). Кроме того, на поверхности эозинофилов присутствуют интег-рины, селектины и рецепторы к компонентам комплемента С4- и Clq (Giembycz, Lindsay, 1999). В отношении окислительной активности эозинофилов выявлено, что IgG-, IgE-комплексы и ФМА стимулируют продукцию Н2О2 (Rossi, 1989), а ИЛ-5 повышает уровень люминол-зависимой хемилюминесценции (Tsai, Yu, Wang, 1993). В то же время эозинофилы являются эстрогензависимыми клетками (Giembycz, Lindsay, 1999), которые аккумулируются из периферической крови в эндометрий, где выполняют иммунорегуляторную и фагоцитарную функции.

Регуляция фагоцитарной активности эозинофилов хорионическим гонадотропином (ХГ) - основным гормоном беременности - практически не изучена. ХГ помимо регуляции стероидогенеза плаценты и плода активно участвует в контроле иммунных процессов (Hammarstrom et al., 1979; Yagel et al., 1989; Magnie et al., 1990; Ширшев 1997; 1998), что обусловлено необходимостью одновременного обеспечения процессов беременности и защиты полуаллогенного плода от атаки иммунокомпетентных клеток матери. Таким образом, целью работы являлось изучение влияния ХГ на фагоцитарную активность эозинофилов.

Известно, что в период гестации и в течение 711 месяцев после родов биологически активный ХГ синтезируется NK-клетками, моноцитами и в меньшей степени лимфоцитами периферической крови, причем пик секреции приходится на 9-16 неделю беременности (Alexander et al., 1998). Флуориметрическими исследованиями с использованием антител к ХГ выявлено связывание гормона этими клетками, реализуемое через ЛГ/ХГ-рецептор (Alexander et al. 1998). Однако на гранулоцитах этот рецептор не идентифицирован, что позволяет предположить, что ХГ реализует свои

О С. А. Заморина, С. В. Ширшев, 2005

эффекты в данном случае через «альтернативную» мембранную структуру - TLRs (toll-like receptors), внеклеточные домены которых гомологичны гор-монсвязывающему сайту ЛГ/ХГ-рецептора (Takahashi et al, 1985). Известно, что эозинофилы конститутивно экспрессируют TLR1, TLR4, TLR7, TLR9 и TLR10 mRNAs (Nagase, 2003) и способны к ЛПС-зависимой активации с вовлечением CD 14 (Plotz et al. 2001), вследствие чего мы предполагаем, что гормон реализует свои модулирующие эффекты через TLRs.

Материалы и методы

В работе использовали цельную кровь небеременных женщин в возрасте 19-48 лет. Обследуемые женщины были разделены на две группы в зависимости от фазы менструального цикла: первая («фолликулярная фаза») состояла из женщин, у которых кровь забирали на 5-9 день менструального цикла (п=8); вторая («лютеиновая фаза») группа состояла из женщин, у которых кровь брали на 1825 день цикла (п=8).

Использовался XT («profasi», Serano, Италия) в дозах 10, 50 и 100 МЕ/мл, что соответствует разным срокам беременности. На 50-й день (7 нед.) беременности концентрация гормона достигает 50 МЕ/мл, на 70-й день (10 нед.) - 100 МЕ/мл, в последующие П-Ш триместры концентрация гормона снижается до 10 МЕ/мл и держится на таком уровне до конца беременности (Wide, 1962; Jaffe, 1969). Гормон разводили ex tempore средой 199 (НПО «Биомед», Россия).

В качестве ингибитора кальмодулина (Carsten, 1982) использовали циклоспорин А (ЦсА) “San-dimmun” (Sandos, Швейцария) в среднетерапевтической дозе 0,05 мг/мл (Обух, 1988).

Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали с помощью светового микроскопа, регистрируя поглощение объектов фагоцитоза. В качестве объектов использовали формалинизированные эритроциты барана (ФЭБ) (Каплин, 1996), трижды отмытые в избытке среды 199 центрифугированием при 400 g. Концентрацию ФЭБ в суспензии доводили до 108/мл.

Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови в капроновых пробирках смешивали 0,1 мл цельной гепаринизированной крови и 0,1 мл отмытых ФЭБ. Пробы инкубировали 20 мин при 37°С. Затем содержимое пробирок ресуспендировали и готовили мазки, которые фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Время окрашивания (15-20 мин) подбирали таким образом, чтобы ФЭБ имели сине-фиолетовую окраску, а собственные эритроциты - розовую. Подсчет вели под иммерсией (объектив х90), просчитывали не менее 300 клеток на мазке. Рассчитывали следующие показатели:

• 1)    процент фагоцитоза - количество клеток, за

хвативших один и более объектов фагоцитоза (ФЭБ^на 100 потенциальных фагоцитов;

• 2)    фагоцитарный индекс (ФИ) - количество объектов фагоцитоза, которое приходится на одну фагоцитирующую клетку («истинный» фагоцит), что характеризует индивидуальную поглотительную активность фагоцитов.

Парциальную фагоцитарную активность оценивали в цельной крови, рассчитывая указанные показатели отдельно для эозинофилов.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием /-критерия Стьюдента, как парного (а), так и непарного (Ь).

Результаты и обсуждение

Известно, что функционально менструальный цикл может быть разделен на фазы, в динамике которых уровень циркулирующих гонадотропинов, эстрогенов, андрогенов и прогестинов изменяется (Midgley, Jaffe, 1968). Фолликулярная фаза характеризуется низким уровнем прогестерона и 17-оксипрогестерона, но относительно высокой концентрацией гонадотропинов и эстрогенов. Наиболее существенным эндокринным проявлением лютеиновой фазы является выраженное увеличение секреции прогестерона. Параллельно, но в меньшей степени, нарастает уровень 17-оксипрогесте-рона, эстрадиола и эстрогена, снижаются уровни ЛГ и ФСГ в плазме (Judd, Yen, 1973).

Для расшифровки механизма действия ХГ на фагоцитоз эозинофилов использовали циклоспорин А (ЦсА). Известно, что ХГ реализует иммуномодулирующие эффекты через Са2+-зависимые механизмы (Ширшев, 1998). Ввиду селективной активности ЦсА в отношении Са2+-акцептирующих белков предполагается следующий механизм действия в этих клетках: взаимодействие препарата с циклофилинами (O’Neil et al, 1995) приводит к образованию комплекса с кальцийневрином, что необходимо для реализации эффекта на уровне экспрессии цитокиновых генов (Morris, 1981; Borel, 1986). Выявлено наличие циклофилинов в нелимфоидных клетках, в частности эозинофилах (Giembycz, Lindsay, 1999). Помимо кальцийневри-на ЦсА блокирует работу кальмодулина (Carsten, 1982), участвующего в фосфорилировании протеинов, и других Са2+-акцептирующих белков (Morris, 1981; Borel, 1986).

Установлено, что в эозинофилах, полученных в фолликулярной фазе, высокая доза ХГ(100МЕ/мл) угнетала все исследуемые показатели фагоцитоза (рис. 1). ЦсА оказывал самостоятельный депрессивный эффект на все исследуемые показатели фагоцитарной активности эозинофилов. Депрессивный эффект ХГ100 МЕ/мл на фоне блокады Са2+-акцептирующих белков полностью снимался, что может объясняться повышением уровня (Са2‘),. В то же время на фоне применения ЦсА проявился депрессивный эффект низкой дозы ХГЮМЕ/мл на фагоцитоз, причем угнетались все исследуемые показатели (рис. 1).

фолликулярная фаза

% фагоцитоза

ФИ О 0.2    0,4    0.6     0,8      1      1,2    1,4

контроль инкубации контроль гормона

ХГ10 МЕ/мл

ХГ50 МЕ/мл

ХГ 100 МЕ/мл

• ЦсА

XTlOME/wn-ЦсА ХГ50 МЕ/мл+ЦсА

ХГ1 ОО МЕ/мл+ЦсА

Рис. 1. Влияние ХГ на фагоцитарную активность эозинофилов периферической крови, находящихся в фолликулярной фазе цикла у женщин. Роль

■ Са2+-акцептирующих белков

В лютеиновую фазу менструального цикла гормон в дозе Ю0МЕ/мл угнетал только поглотительную активность эозинофилов (ФИ), но не фагоцитарную активность. ЦсА оказывал аналогичное действие. Низкая доза ХГЮМЕ/мл на фоне блокады кальмодулина, напротив, оказывала супрессивное влияние на уровень фагоцитирующих эозинофилов (рис. 2).

Таким образом, в эозинофилах депрессивный эффект ХГ реализуется по-разному. В фолликулярной фазе гормоном предположительно модулируется конформация мембран посредством изменения уровней внутриклеточного цАМФ и Са2+, в результате чего происходит маскировка, блокада или утрата рецепторов, в том числе и для ХГ. В лютеиновую фазу, напротив, число распознающих поверхностных структур, по-видимому, не меняется, но депрессивный эффект гормона затрагивает функционирование актин-миозинового комплекса. На фоне блокады кальмодулина и других Са2+-акцептирующих белков гормон реализует разнона правленные дозозависимые эффекты.

лютеиновая фаза

Ve^Dn-mnrzlJ

0       20      40      60       60      100

контроль инкубации контроль горное

ХГЮМЕ/мл

ХГ50 МЕ/мл

ХГЮОМЕАш

ЦсА

ХГ 10 МЕ/мл* ЦсА

ХГ50 МЕ/мл+ЦсА

ХГ100 МЕ/мл+ЦсА

Рис. 2. Влияние ХГ на фагоцитарную активность эозинофилов периферической крови, находящихся в лютеиновой фазе цикла у женщин. Роль Са2+-акцептирующих белков

В фагоцитирующих клетках, особенно на периферии цитоплазмы, содержится большое количество актина и миозина. Образование псевдоподий вокруг объекта фагоцитоза связано с мобилизацией ионов Са2+, которые стимулируют энергозависимую сборку и функционирование сократительных белков (Jonhson, Kitogawa, 1985). Вероятно, избыточный уровень (Са2+); в условиях применения ЦсА нарушает текучесть мембран и адекватное функционирование ферментных комплексов, локализуемых в них, вследствие этого ЦсА оказывает преимущественно депрессивное влияние на фагоцитарную активность эозинофилов.

Однако при пересечении эффектов ЦсА с действием ХГ фагоцитоз может стимулироваться за счет вовлечения активационного сигнала с TLRs. Известно, что сигналы с TLRs могут регулировать фагоцитарную активность клеток, способствуя поглощению микробных объектов на разных стадиях фагоцитоза (Blander, Medzhitov, 2004). В то же время разница эффектов в разные фазы цикла объясняется стероид-зависимой экспрессией TLRs на клетках.

Таким образом, ХГ способен угнетать фагоцитарную активность эозинофилов в крови человека, при этом наиболее выраженный эффект наблюдался по отношению к эозинофилам, полученным из крови женщин в фолликулярной фазе менструального цикла. Направленность эффекта гормона зависит от функционирования Са2+-акцептирующих белков, таких как кальмодулин и кальцийневрин. ХГ на фоне блокады вышеназванных белков оказывает преимущественно стимулирующий эффект на фагоцитарную активность эозинофилов, вероятно, за счет включения активационного сигнала с TLRs. Возможно, гормон взаимодействует на поверхности эозинофилов с TLRs, потому как внеклеточные домены этих белков гомологичны гор-монсвязывающему сайту ЛГ/ХГ-рецептора. Однако нельзя исключать вероятности прямого контакта эозинофилов с другими лейкоцитами в условиях цельной крови, вследствие чего происходит модуляция фагоцитарной активности эозинофилов.