Влияние ингибиторов фосфодиэстеразы 5-го типа на подвижность сперматозоидов человека в эксперименте in vitro

ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России, Москва

настоящее время эректильная дисфункция (ЭД) признана широко распространенным состоянием [1-4], а огромное число мужчин относительно бесконтрольно применяют различного рода специализи- рованные препараты. Лекарством первой линии терапии эректильной дисфункции являются ингибиторы фосфодиэстеразы 5-го типа (иФДЭ5). На российском фармацевтическом рынке в настоящее время представлено четыре эректогенных препарата из группы иФДЭ5 (силденафил, тада-лафил, варденафил, уденафил). Их появление явилось революцией в лечении ЭД. Это вызывает необходи- мость внимательного изучения потенциальных нежелательных или побочных эффектов на мужское здоровье, в том числе репродуктивное.

Отмечена высокая клиническая эффективность этих препаратов, которая превышает 70% [5, 6]. Несмотря на высокую избирательность, все иФДЭ5, тем не менее, воздействуют и на другие изоферменты ФДЭ, локализованные в различных тканях организма. В настоящее время известно 11 основных групп (ФДЭ1–11), которые в свою очередь разделяются на 21 подгруппу и 54 варианта. Изоферменты ФДЭ участвуют в осуществлении различных функций организма, а по своему химическому строению зачастую очень схожи [7].

В литературе описаны попытки изучить и структурировать данные о распределении изоферментов ФДЭ в организме и их возможных функциях [8, 9]. На сегодняшний день ФДЭ11 – это последнее семейство из открытых наукой изоферментов в организме человека. Оно подразделяется на ФДЭ11A1, ФДЭ11A2, ФДЭ11A3 и ФДЭ11A4. Было высказано предположение о том, что именно это семейство может принимать участие в регуляции процессов сперматогенеза, так как различные исследователи находили ФДЭ11 в герминогенном эпителии, семявыносящих канальцах, клетках Лейдига и сперматозоидах [10-12]. Установлен факт, что именно ФДЭ11А3 является наиболее широко представленной изоформой в яичках [13-15].

Научный мир последнее десятилетие постоянно возвращается к вопросу о влиянии широко распространенных препаратов иФДЭ5 на характеристики спермы и сперматогенез. В ряде исследований проведён анализ роли ФДЭ11 в сперматогенезе и рассмотрены возможные механизмы её воздействия. Достаточно большое количество экспериментальных работ по влиянию иФДЭ5 на сперму было проведено в последнее время. После выхода силденафила на фармацевтический рынок многие научные работы были посвящены влиянию препарата на характеристики сперматозоидов in vitro. Группа ученых во главе с Burger M. et al. [16] в ex vivo исследованиях изучали влияние силденафила на подвижность, жизнеспособность, в целостность мембраны и способность к оплодотворению человеческого сперматозоида. Убедительных данных о каком-либо клинически значимом влиянии силденафила на параметры сперматозоидов получено не было.

Mostafa T. et al. [17] продемонстрировали стимулирующий эффект силденафила на подвижность сперматозоидов, зависящий от концентрации препарата. В работе Lefievre L. et al. [18] также исследовалось влияние силденафила на параметры сперматозоида. Авторы показали, что этот препарат стимулирует подвижность сперматозоидов. В другом исследовании, проведенном Cuadra DL. et al. [19], посвященном влиянию силденафила на подвижность сперматозоидов, было установлено воздействие препарата на акросомальную реакцию.

В настоящее время силденафил является одним из самых изученных препаратов, но, тем не менее, как видно из вышеописанных исследований, существуют противоречия между полученными выводами. Несмотря на большое количество исследований на данную тему, у ученых нет единого мнения по данному вопросу. Имеется много, порой диаметрально противоположных точек зрения. Одни авторы говорят об отсутствии какого–либо влияния иФДЭ5 на основные характеристики сперматозоидов [17]. В то же время, другие ученые демонстрируют убедительные данные о том или ином воздействии иФДЭ5 на подвижность, жизнеспособность и целостность мембраны сперматозоидов [18, 19].

Таким образом, можно сделать вывод, что основным препаратом в научных изысканиях служил силденафил. Единичные работы проводились с тада-лафилом и варденафилом. Менее всего данных встречается об уденафиле.

Целью настоящего исследования явилось определение влияния всех четырех реализируемых в России иФДЭ5 (силденафила, тадалафила, варденафила, уденафила) на один из основных параметров сперматозоидов - подвижность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведено рандомизированное исследование, в котором in vitro было изучено влияние на подвижность сперматозоидов всех четырех, используемых в

России, иФДЭ5. В данной работе исследовали образцы спермы от 182 клинически фертильных пациентов. Образцы собирали в стерильную посуду после 5дневного полового воздержания. Затем каждый образец был разделен на 2 части по 0,1 мл с равной концентрацией сперматозоидов (около 10х10 ⁶ ).

После рандомизации образцы спермы были выдержаны при комнатной температуре 21-24 ^О С.

Согласно разработанному плану рандомизации образцы основной группы были подвергнуты влиянию растворов того или иного ингибитора в виде химически чистого вещества, остальные образцы использовали в качестве контроля. Анализу подвергались исходные образцы спермы, затем образцы из контрольной и основной групп исследовали через 1 и 3 часа.

Образцы спермы первой группы проходили экспозицию с силденафилом . Она была разделена на подгруппу из 30 образцов, подвергнутых воздействию раствора силденафила в концентрации 25 нг/мл, и подгруппу из 32 образцов - с концентрацией силденафила 250 нг/мл. Средний возраст пациентов, от которых были получены образцы спермы, в группе силденафила составил 29,77±6,67 г.

Вторая группа состояла из 30 образцов эякулята, проходивших экспозицию с тадалафилом в концентрации 100 нг/мл. Средний возраст пациентов, от которых были получены образцы в группе тадалафила, составил 32,50±6,69 г.

Третья группа образцов проходила экспозицию с варденафилом в концентрации 50 нг/мл и состояла из 31 образца спермы. Средний возраст пациентов, от которых были получены образцы в группе варденафила, составил 31,45±7,26 г.

Последняя 4 группа была подвергнута воздействию раствора уденафила и состояла из 30 образцов, которые экспонировались при концентрации препарата 50 нг/мл, и 29 образцов спермы - при концентрации 100 нг/мл. Средний возраст пациентов, от которых были получены образцы спермы в группе удена-фила, составил 26,86±5,01 г.

В настоящем эксперименте оценивалась подвижность сперматозоидов с быстрым поступательным движением (подвижность А). Скорость движения таких сперматозоидов составляет более чем пять длин головок или половины хвоста за 1 секунду. Также оценивались малоподвижные сперматозоиды с прямолинейным движением (подвиж- ность В). Скорость движения таких сперматозоидов составляет менее чем пять длин головок или половины хвоста за 1 секунду.

Все образцы спермы подвергались анализу одним и тем же исследователем. Статистическая обработка выполнялась в программе Statistica 6.0. Для описания и сравнения подвижности сперматозоидов, представленной в виде ряда относительных данных, применяли следующие методы. При описательной статистике использовали медиану и интерквартильный размах, минимум, максимум, а также среднее арифметическое с 95% доверительным интервалом или стандартным отклонением.

Для сравнения двух независимых групп использовали критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney test); для сравнения двух зависимых групп – критерий Вилкоксона (Wilcoxon test); а для сравнения более двух независимых групп – критерий Краскел-Уоллиса (Kruskal-Wallis ANOVA). Для исследования взаимосвязи признаков между собой определялся коэффициент корреляции Спирмена (r). Значение r интерпретировалось следующим образом: 0,25 и меньше – слабая корреляция; 0,26 –0,75 - умеренная; более 0,75 - сильная.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Силденафил . При изучении данного препарата мы использовали две концентрации: 25 и 250 нг/мл. Выбор именно этих значений обусловлен изученным нами ранее влиянием различных концентраций действующего вещества на подвижность сперматозоидов. В минимальной концентрации (25нг/мл) препарат оказывает стимулирующее воздействие на подвижность, а с нарастанием концентрации (250 нг/мл) мы наблюдали уже угнетающее воздействие на подвижность сперматозоидов. При статистической обработке был получен график подвижности сперматозоидов в контрольной и основных группах в зави-симостиот концентрации действующего вещества и времени наблюдения (рис. 1). На приведенном графике по горизонтальной оси расположены значения концентраций действующего вещества, по вертикальной - % подвижных сперматозоидов. Таким образом, данная зависимость наглядно демонстрирует резкое повышение подвижности А на концентрации 25 нг/мл и такое же значительное падение подвижности А на концентра-

Рис. 1. Изменения подвижности А в контрольной и основных группах

Рис. 2. Изменения подвижности В в контрольной и основных группах

Рис.3. Изменения подвижности В к 60 минуте в основной группе при Рис. 4. Изменения подвижности А+В концентрации силденафила 250 нг/мл

Рис. 5. Влияние силденафила на подвижность сперматозоидов

ции 250 нг/мл, разница между исходной подвижностью А и подвижностью А к 60 минуте статистически значима (p=0.0000).

При обработке данных тестом Манна-Уитни мы оценили разницу между основными (25 и 250 нг/мл) и контрольной группами к 60 минуте. По- лучив статистически значимую разницу (p=00000), можно утверждать, что силденафил стимулирует подвижность А при концентрации действующего вещества 25 нг/ мл и угнетает при концентрации 250 нг/мл. При исследовании подвижности В была замечена другая закономерность: и на концентрации 25 нг/мл и 250 нг/мл происходило увеличение подвижности В к 60 минуте (p<0.05), что демон стрирует приведенный график (рис. 2).

Полученные данные мы трактовали следующим образом: увеличение подвижности В на концентрации 25 нг/мл мы объясняли стимулирующим эффектом силденафила; увеличение подвижности В при концентрации действующего вещества 250 нг/мл мы интерпретировали как переход сперматозоидов из активноподвижных с прогрессивном движением (подвижность

А) в малоподвижные с прогрессивным движением (подвижность В) (рис. 3). Однако при изучении общей подвижности сперматозоидов с прогрессивным движением (А+В) (рис. 4) было отмечено её снижение.

В эксперименте наблюдается резкое увеличение общей подвижности (А+В) при экспозиции с силденафилом в концетрации 25 нг/мл (p=0,0000) и выраженная тенденция к угнетению общей подвижности (А+В) при концентрации 250 нг/мл (p= 0.09). В проведенном исследовании сравнивалась также подвижность (А+В) к 60 минуте в контрольной и основной группах при концентрации 250 нг/мл. Получив статистически значимую разницу между группами (p=0,04), можно утверждать, что силденафил угнетает общую подвижность при концентрации действующего вещества 250 нг/мл. Данные по влиянию силденафила на подвижность сперматозоидов наглядно представлены в сводном графике (рис. 5). □

Рис. 6. Изменения подвижности А в контрольной и основной группах

Рис.7. Изменениея подвижности А в контрольной и основной группах к 60 мин (тадалафил)

Рис.10. Подвижность А+В в контрольной и основной группах к 180 мин Рис. 11. Влияние тадалафила на подвижность сперматозоидов (тадалафил)

Рис.8. Изменения подвижности А+В в контрольной и основной группах Рис.9. Изменения подвижности А+В в контрольной и основной группах к 60 мин (тадалафил)

Тадалафил . Данный препарат нами представлен в одной лишь концентрации 100 нг/мл, так как именно при этой концентрации начинали происходить изменения в подвижности сперматозоидов. Изменения эти имели угнетающий характер. На рис.6 представлен график, из которого видно, что подвижность А к 60 минуте снижается статистически значимо по сравнению с подвижностью А при исходном исследовании (p=0.03), но значимой (p=0,13) разницы между контрольной и основной группами к 60 минуте не выявлено (рис. 7).

Также нет статистически значимой разницы между контрольной и основной группами и к 180 минуте исследования образцов (p=0.07). При анализе подвижности В наблюдалось значимое снижение подвижности сперматозоидов к 60 минуте (p=0.006). Однако при сравнении подвижности В к 60 минуте между контрольной и основными группами статистически значимой разницы получено не было (p=0.16). Приведенный график (рис. 8) демонстрирует изменение общей подвижности (А+В). В основной группе общая подвижность к 60 минуте значимо снизилась по отношению к исходной подвижности (p=0.000), однако значимой разницы между изменениями подвижности А+В к 60 минуте исследования в контрольной и основной группами найдено не было (рис. 9). Тем не менее, к 180 минуте исследования разница между контрольной и основными группами возрастает (p=0.03) (рис. 10). Таким образом, наша экспериментальная работа показывает, что тадалафил угнетает подвижность сперматозоидов в концентрации 100 нг/мл, что наглядно представлено на общем сводном графике (рис. 11).

Рис. 12. Изменения подвижности А в контрольной и основной группах

Рис.13. Изменения подвижности А в контрольной и основной группах к 60 мин (варденафил)

Рис. 14. Изменения подвижности А+В в основной группе

Рис. 15. Влияние варденафила на подвижность сперматозоидов

Варденафил . Препарат, так же как и тадалафил, представлен в одной концентрации, но уже 50 нг/мл. При экспозиции образцов спермы с действующем веществом варденафила именно при концентрации 50 нг/мл начинали происходить выраженные изменения подвижности сперматозоидов угнетающего характера. При исследовании подвижности А было определено, насколько выражено (в отличие от тадалафила) происходит ее угнетение на фоне варденафила (рис. 12). Подвижность А к 60 минуте снижается статистически значимо по сравнению с подвижностью А при исходном исследовании образцов спермы в основной группе (p=0.000000). Также наблюдались достоверные различия между контрольной и основными группами к 60 минуте (p=0.00000) (рис. 13).

Отчетливое снижение подвижности В произошло в основной группе к 60 минуте как по сравнению с исходными показателями (p=0.000), так и по сравнению с показателями подвижности В в контрольной группе к 60 минуте (p=0.000). Таким образом, анализируя подвижность А+В, мы видим выраженное угнетение варде-нафилом общей подвижности сперматозоидов, что отражено на приведенном графике (рис. 14). Снижение общей подвижности в основной группе к 60 минуте происходит как по сравнению с контрольной группой (p=0.0000), так и по сравнению с исходными показателями общей подвижности (p=0.00000). Угнетение подвижности особенно хорошо демонстрирует общий график, построенный по медианам подвижности (рис. 15).

Уденафил. По данному препарату изучалось влияние двух представленных концентраций: 50 и 100 нг/мл. В ходе исследования подвижности сперматозоидов ее изменения начинали происходить при концентрации действующего вещества 50 нг/мл. Препарат оказывал сти- мулирующее воздействие на подвижность, а с нарастанием концентрации мы начинали наблюдать уже угнетающее воздействие на подвижность сперматозоидов. Начало подавления подвижности происходило уже при концентрации 100нг/мл. При статистической обработке данных было установлено статистически незначимое (p=0,67) увеличение подвижности А к 60 минуте исследования при концентрации 50 нг/мл по сравнению с исходными показателями основной группы. Однако при дальнейшем наблюдении к 180 минуте было отмечено увеличение подвижности до значимых пределов (p=0,0000) (рис. 16).

При исследовании подвижности А в образцах спермы, экспонированных с уденафилом в концентрации 100 нг/мл, мы наблюдаем статистически значимое (p=0,000) снижение подвижности уже к 60 минуте эксперимента. Таким образом, сравнивать подвижность А в контрольной и □

Рис. 16. Изменения подвижности А в контрольной и основных группах

Рис.17. Изменения подвижности А в контрольной и основных группах к 180 мин (уденафил)

Рис. 18. Изменения общей подвижности А+В в контрольной и основных группах

Рис.19. Изменения общей подвижности А+В в контрольной и основных группах к 180 мин (уденафил)

основных группах (50 нг/мл и 100 нг/мл), вероятно, целесообразней к 180 минуте, так как именно в это время в группе с концентрацией уденафила 50 нг/мл происходят наиболее выраженные изменения (рис. 17).

Анализируя подвижность В, надо отметить, что значимых изменений к 60 минуте в группе концентрации 50 нг/мл не происходит как по сравнению с исходными показателями основной группы (p=0,94), так и по сравнению с контрольной группой к 60 минуте наблюдения (p=0.67). В группе образцов, экспонированных с уденафилом в концентрации 100 нг/мл, отмечалось значимое снижение подвижности В по сравнению с исходными показателями основной группы (p=0,04), однако не наблюдалось значимого снижения подвижности В по сравнению с контрольной группой к 60 минуте наблюдения (p=0.06).

Но при дальнейшем сравнении с контрольной группой к 180 минуте отмечается статистически значимое снижение подвижности В (p=0.000).

Таким образом, переводя статистически обработанные данные общей подвижности А+В в графическое изображение (рис.18), мы получаем наглядное представление о влиянии уденафила на общую подвижность сперматозоидов. Из графика следует, что препарат оказывает стимулирующее воздействие в концентрации 50 нг/мл к 180 минуте наблюдения (p=0,00000) и оказывает подавляющее влияние уже к 60 минуте наблюдения (p=0,0000). Достаточно наглядно это можно продемонстрировать графиком, показывающим общую подвижность сперматозоидов А+В через 3 часа наблюдения на разных концентрациях действующего вещества (рис.19).

ОБСУЖДЕНИЕ И ВЫВОДЫ

В настоящей работе исследовалось влияние на подвижность сперматозоидов всех четырех иФДЭ5, присутствующих на фармацевтическом рынке России. Подвижность сперматозоидов является далеко не единственным определяющим фертильность параметром, но, без сомнения, - это один из ключевых факторов, на который обращают внимание при исследовании образцов спермы. При исследовании представлены различные дозировки действующих веществ: силденафил в концентрации 25 нг/мл и 250 нг/мл; варденафил - 50 нг/мл; тада-лафил - 100 нг/мл; уденафил - 50 нг/мл и 100 нг/мл. При экспозиции образцов спермы именно с данными концентрациями препаратов мы наблюдали изменения угнетающего или стимулирующего характера.

Обеспечивает необходимую для эрекции твердость1

Увеличивает способность сохранять и поддерживать эрекцию1

Высокая эффективность и степень удовлетворённости пациентов1 Оптимальная продолжительность действия234

Высокий профиль безопасности в классе ингибиторов ФДЭ-51234

• 1.    Отчет по клиническому исследованию: «Рандомизированное, плацебо-контролируемое, двойное слепое исследование на параллельных группах с целью оценки безопасности и эффективности уденафила при использовании фиксированных доз у мужчин с эректильной дисфункцией лёгкой и средней степени (Фаза III), 2005.

  
  
  

• 2.    Инструкция по медицинскому применению препарата Зидена®.

• 3.    Исследование «Рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое исследование с целью оценки безопасности, переносимости и изучения фармакокинетики / фармакодинамики уденафила при однократном и многократном приеме с повышением дозы на последовательных группах у здоровых мужчин корейской национальности [Фаза I].

• 4.    Paik JS, Kim SW, Yang DY et al., The efficacy and safety of udenafil, a new selective phosphodiesterase type 5 inhibitors, in patients with erectile dysfunction. J Sex Med. 2008 Apr; 5(4): 946-53.