Влияние экспериментального перитонита и экспериментальной пневмонии на структурные изменения яичников самок белых крыс

Яичники – парный женский репродуктивный орган, в котором созревают ооциты, а также вырабатываются гормоны, такие как эстроген и прогестерон. Яичник у взрослой женщины в репродуктивном возрасте имеет размер 4,0–2,5–1,5 см.

С гистологической точки зрения в нем выделяют корковое и мозговое вещество [1]. Корковое вещество состоит из тесно расположенных веретеновидных клеток, напоминающих набухшие фибробласты, межклеточного вещества в нем мало, а в тонкой внешней зоне этого вещества прослеживается полоса коллагеновой стромы, которая содержит относительно мало клеток. Мозговое вещество яичников построено из рыхлой соединительной ткани.

Во внутренней зоне коркового вещества яичников располагаются фолликулы, являющиеся его основной структурно-функциональной единицей. Согласно Международной гистологической номенклатуре (1983), фолликулы подразделяются на:

примордиальные – самый маленький и примитивный тип фолликулов, содержащий один слой уплощенных фолликулярных клеток, окружающих ооцит 1 порядка;

первичные – эти фолликулы больше, чем примордиальные, содержат один слой фолликулярных клеток кубической, цилиндрической или округлой формы. Они также имеют прозрачное пространство, называемое zona pellucida, окружающее ооцит;

вторичные – имеют размер больше первичных фолликулов, содержат два или более слоев фолликулярных клеток, которые формируют полость фолликула, называемую антральным отделом;

третичные – самый крупный и наиболее зрелый тип фолликула, который полностью развит и готов к овуляции. Они имеют хорошо развитый антральный отдел, заполненный фолликулярной жидкостью, эксцентрично расположенный ооцит, окруженный 2–3 слоями образующих яйценосный бугорок гранулезных клеток, высокую митотическую активность фолликулоцитов.

В яичнике также можно обнаружить атретические фолликулы – это фолликулы, которые подверглись дегенерации и апоптозу из-за различных факторов, и атретические тела – структуры, которые образуются после разрушения и поглощения окру-жающими стромальными клетками атритического фолликула. Они обычно небольшие и состоят из плотной волокнистой ткани.

Желтые тела образуются после овуляции, когда лопнувший фолликул разрушается. Клетки, выстилающие фолликул, дифференцируются в лютеиновые клетки, которые отвечают за выработку прогестерона и эстрогена.

Если оплодотворения не происходит, желтое тело начинает регрессировать примерно через 12 дней и в конечном итоге заменяется белым телом, которое представляет собой гормонально неактивную волокнистую ткань.

Процесс перехода одного типа фолликулов в другой достаточно сложный и регулируется множеством факторов [2]. В частности, за этот процесс могут отвечать фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинизирующий (ЛГ) гормоны, которые вырабатываются гипофизом. ФСГ способствует росту и созреванию маленьких незрелых фолликулов, в то время как ЛГ запускает овуляцию зрелых фолликулов. Также существенную роль в созревании и развитии фолликулов играют гранулезные клетки – слой соматических клеток, окружающих ооцит [3].

Ряд авторов утверждает, что некоторые факторы окружающей среды, например, питание, стресс, воздействие токсинов, наличие хронических заболеваний, могут влиять на фолликулогенез [4]. Ранее проведенные нами исследования показали, что у женщин, имеющих хроническую экстрагенитальную патологию дыхательной и/или пищеварительной систем, ухудшается фертильность, в частности изменяется количество зрелых фолликулов и ооцитов [5]. В связи с необходимостью детального изучения влияния данной патологии на изменения структуры яичников было проведено настоящее исследование.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить влияние экспериментальной пневмонии и экспериментального перитонита на структуру яичника самок белых крыс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 30 белых крысах-самках линии Wistar массой 300–325 г, поделенных на 3 группы. Животные содержались в стандартных условиях вивария согласно правилам GLP при проведении доклинических исследований в РФ (Приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики»). Экспериментальное исследование было одобрено Экспертным советом по биомедицинской этике (локальным этическим комитетом) ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ (справка № 2021/053 от 27.05.2021). Ежедневно в течение 7 суток у всех крыс брались влагалищные смывы 0,3 мл физиологического раствора с дальнейшим их окрашиванием 0,5%-м раствором метиленового синего и микроскопированием (микроскоп «Биомед», увеличение 200) для определения стадии эстрального цикла. Последующее исследование у всех крыс осуществлялось в стадию диэструса.

В первую экспериментальную группу вошли 10 крыс со смоделированным перитонитом путем ин-траперитониального введения 1 мл 7%-й аутокаловой взвеси в физиологическом растворе с 1 каплей скипидара [6]. Во вторую – 10 животных со смоделированной пневмонией путем чрескожного введения в паренхиму легких 0,4 мл дважды профильтрованной через тройной слой стерильной марли взвеси аутокала в физиологическом растворе в пропорции 1 : 10 [7]. Третья группа – контрольная, куда вошли, содержавшиеся в виварии наряду с первой и второй группами животные, на которых не моделировали патологию (10 крыс).

Три экспериментальных группы животных имели свободный доступ к питьевой воде и пище. Первую группу животных выводили из эксперимента через сутки, вторую и третью – через 7 суток, предварительно наркотизировав хлоралгидратом из расчета 400 мг/кг массы.

Для морфологического исследования брали правый яичник, фиксировали его в 10%-м забуфе-ренном формалине, проводили по батареи восходящих спиртов, заливали в парафин.

Срезы тканей толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Световая микроскопия выполнялась на микроскопе Imager. A2.AXIO (ZEISS) при использовании объективов ×10, 20, 40, с последующим фотографированием фотокамерой Axiocam 305 color (ZEISS). На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, проводили обзорную оценку яичников с последующим морфометрическим исследованием. Морфометрическое исследование проводили по всей поверхности среза яичников (ок. ×10, об. ×10), определяли среднее количество примордиальных, первичных, вторичных, третичных фолликулов, атре-тических фолликулов и атретических тел, желтых тел на разных стадиях развития, белых тел.

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 3.1.4 (разработчик – ООО «Статтех», Россия). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро – Уилка. В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1; Q3).

Сравнение трех и более групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью критерия Краскела – Уоллиса.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При микроскопическом исследовании яичников животных контрольной группы четко определяются все слои: корковое и мозговое вещество яичника. Поверхность яичников покрыта однослойным кубическим эпителием, под эпителием располагается белочная оболочка.

В корковом веществе яичников выявляются фолликулы, которые расположены в соединительнотканной строме и находятся на различных стадиях развития. Примордиальные фолликулы многочисленные, расположены в виде цепочек и групп в поверхностных участках коркового вещества. Растущие фолликулы представлены единичными первичными, вторичными и третичными фолликулами, имеющими характерное строение для каждого вида фолликулов. Во вторичных и третичных фолликулах отмечается высокая митотическая активность. В отдельных участках расположены единичные атретические фолликулы и единичные атретические тела.

Желтые тела, расположенные в корковом веществе яичников, находятся на различных стадиях развития: большинство желтых тел окружено тонкой соединительнотканной капсулой, с многочисленными капиллярами, представлено полигональными гранулезными лютеоцитами и расположенными на периферии лютеоцитами теки, в цитоплазме лютеоцитов некоторых желтых тел отмечается очаговая вакуолизация. Некоторые желтые тела находятся на стадии обратного развития, в центральной части этих желтых тел определяются разрастания рубцовой соединительной ткани. В отдельных участках расположены единичные белые тела.

Мозговое вещество яичников представлено соединительной тканью с сосудами, в воротах яичников обнаруживались очаговые скопления из эпителиальных тяжей и трубочек, выстланных кубическим эпителием (сеть яичника).

При микроскопическом исследовании яичников животных с экспериментальным перитонитом, в отличие от контрольной группы, примордиальные фолликулы единичные, визуализируются в виде отдельно расположенных фолликулов в поверхностных участках коркового вещества, а растущие фолликулы представлены первичными, вторичными и третичными фолликулами, имеющими характерное строение.

В отдельных участках расположены атретические фолликулы и атретические тела в большем количестве, чем в контрольной группе.

В яичниках экспериментальных животных этой группы отмечается выраженное полнокровие сосудов, очаговые эритростазы, обширные участки зрелой грануляционной ткани.

При микроскопическом исследовании яичников животных с экспериментальной пневмонией отмечается небольшое количество примордиальных фолликулов, растущие фолликулы представлены единичными первичными, вторичными и третичными фолликулами, имеющими характерное строение для каждого вида фолликулов.

Во вторичных и третичных фолликулах отмечаются единичные митозы, множественные апоптотиче-ские тельца. В отдельных участках распологались атретические фолликулы и единичные атретические тела. Отмечается более высокое содержание атрети-ческих фолликулов, атрезии преимущественно подвергались первичные и вторичные фолликулы. Также практически во всех желтых телах выявляются многочисленные фибробласты, выраженное полнокровие капилляров.

Количественные показатели структурных компонентов коркового вещества яичников самок крыс каждой группы представлены в таблице.

Количественные показатели структурных компонентов коркового вещества яичника самок белых крыс

Структурные компоненты коркового вещества яичников	Группа животных с экспериментальным перитонитом	Группа животных с экспериментальной пневмонией	Контрольная группа животных
Примордиальные фолликулы	20,00 [30,50; 38,25]*	4,00 [4,00; 4,00] * "	33,50 [30,50; 38,25]
Первичные фолликулы	1,00 [0,00; 1,00]	5,00 [2,00; 6,00] * "	1,50 [1,00; 2,25]
Вторичные фолликулы	2,00 [1,00; 2,00]	7,00 [7,00; 11,00] * "	1,50 [1,00; 2,00]
Третичные фолликулы	0,00 [0,00; 2,00]	2,00 [0,00; 2,00]	0,50 [0,00; 1,25]
Желтые тела	6,00 [5,00;8,00]*	4,00 [3,00;7,00] * "	3,00 [0,75; 5,00]
Белые тела	0,00 [0,00; 3,00]	0,00 [0,00; 0,00]	1,00 [0,00; 2,00]
Атретические фолликулы	1,00 [1,00; 1,000]	11,00 [7,00; 16,00] * "	1,50 [1,00; 2,00]
Атретические тела	0,00 [0,00; 1,00]	0,00 [0,00; 0,00]	0,00 [0,00; 0,25]

Примечание. Статистически значимые различия по сравнению с контролем, " группой с экспериментальным перитонитом при р < 0,05.

В ходе проведенного исследования установлено, что экспериментальная пневмония и экспериментальный перитонит влияют на структуру яичника. В первую очередь различия касаются структурных компонентов коркового вещества яичника. Отмечается, что у животных экспериментальных групп статистически достоверно уменьшается количество примордиальных фолликулов по сравнению с контролем, причем в группе животных с экспериментальной пневмонией это снижение гораздо значительней. Это может быть следствием нескольких механизмов. Известно, что при перитоните и пневмонии в крови увеличивается циркуляция провоспалитель-ных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6, TNF-α [8]. В литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что медиаторы воспаления могут влиять на рост и дифференцировку фолликулов яичника, то есть переходу одного типа фолликулов в другой [9, 10]. Известно, что IL-1β, IL-6 способны стимулировать мито-ген-активированную протеинкиназу (MAPK), которая, в свою очередь, регулирует пролиферацию, дифференцировку и выживание клеток, включая и клетки фолликула [9]. Механизм влияния TNF-α заключается в индукции апоптоза клеток гранулезы, которые окружают развивающейся ооцит в фолликуле, и снижает экспрессию генов, участвующих в стероидогенезе, что может ухудшать фолликулогенез [11].

Более значительное снижение количества антральных и увеличение первичных и вторичных фолликулов в группе животных с экспериментальной пневмонией по сравнению с контролем и даже группой с экспериментальным перитонитом очевидно объясняется тем, что при пневмонии в организме развивается респираторная форма гипоксии, которая, в свою очередь, может влиять на развитие фолликулов яичников. Один из ведущих механизмов включает регуляцию факторов, индуцируемых гипоксией (HIFs), которые представляют собой белки, играющие ключевую роль в адаптации клеток к низким уровням кислорода [12]. При низком уровне кислорода HIF стабилизируются и перемещаются в ядро, где они действуют как факторы транскрипции, регулирующие экспрессию генов, участвующих в различных клеточных процессах, включая ангиогенез и метаболизм. В исследованиях было показано, что в яичнике HIF регулируют развитие и функцию фолликулов путем модуляции экспрессии генов, участвующих в их дифференцировке [12]. В частности, в экспериментах было показано, что HIF регулируют экспрессию генов, которые способствуют росту вторичных фолликулов, что также подтверждается в ходе нашего исследования. В дополнение к регуляции экспрессии генов, гипоксия также может влиять на развитие фолликулов посредством выработки активных форм кислорода (АФК), которые представляют собой молекулы, способные повреждать клетки и ткани, запуская в них апоптоз [12]. Этим можно объяснить значительное увеличение количества атритических фолликулов в группе животных с пневмонией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Механизмы формирования и развития экспериментального перитонита и экспериментальной пневмонии влияют на структуру яичника, в первую очередь нарушая нормальные процессы фолликулогенеза.