Влияние экстремальных факторов высокогорья на ультраструктуру лейкоцитов крови крыс

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

Как известно, при изучении проблемы формирования биоадаптаций необходимо базироваться не только на основе различных данных эколого-физиологических аспектов приспособительных реакций, но и учитывать морфологические признаки формирования адаптивных процессов в организме. Реакция организма на действие раздражителей, как правило, сопровождается достаточно выраженными морфологическими и физикохимическими изменениями в тканях, возникающих под воздействием экстремальных факторов внешней среды. Среди множества разнообразных факторов внешней среды одним из наиболее значимых с точки зрения эколого-физиологического воздействия, является холод. Температура воздуха оказывает огромное влияние на жизненно-важные функции организма, такие как обмен веществ, терморегуляция, дыхание, кровообращение и др. [1–4].

Цель исследования — изучение динамики изменений морфологических показателей ультраструктуры клетки белой крови у экспериментальных животных при адаптации к высокогорью в сочетании с воздействием холода.

При проведении экспериментального исследования было использовано 50 белых беспородных лабораторных крыс-самцов с массой тела 200–300 г.

• 1    группа (контроль) — 30 крыс-самцов, которые находились в низкогорье (г. Бишкек) в те же сроки (исходные данные, 3 и 30 сутки).

• 2    группа — крысы, пребывающие в высокогорье 3 суток в сочетании с холодовым воздействием;

• 3    группа — крысы, пребывающие в высокогорье 30 суток в сочетании с холодовым воздействием.

Первый этап эксперимента (контрольная группа) проводился в весеннее время в условиях низкогорья в г. Бишкек. Холодовое воздействие моделировали следующим образом: экспериментальные животные на время эксперимента содержались в помещении при температуре 4–6°С в металлических клетках с небольшим количеством подстилки из опилок. Корм и вода давались им в избытке. Вторая и третья серии эксперимента проводились в условиях пребывания животных на высокогорной базе Туя-Ашу в осеннее время в не термостатированных помещениях вивария при температурах 4–6°С в течение 30 дней. Доступ к корму и воде не ограничивался. Забор крови осуществлялся на 3 и 30 сутки пребывания в низкогорье и высокогорье.

Для электронно-микроскопического исследования использовали свежую кровь, стабилизированную гепарином, которую центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Выделенная лейкоцитарная пленка обрабатывалась по общепринятой методике. Фиксацию материала производили немедленно, 2,5% глутаральдегидом на буфере Миллонинга, дофиксацию проводили с использованием 1% раствора тетраоксида осмия (все используемые реактивы фирмы Sigma, США). После обезвоживания препараты заливали в эпон (Fluka, Швейцария) по общепринятой методике [5–7].

Срезы, приготовленные на ультратоме, после контрастирования 2% водным раствором уранилацетата натрия или цитратом свинца, приготовленным по Reinolds [8] просматривались с помощью трансмиссионного электронного микроскопа ПЭМ-100 (JEOL, Япония, 2007). Морфометрический анализ ультраструктуры лейкоцитов проводили по Э. Р. Вейбелю [9–11].

Полученные данные обрабатывались при помощи персонального компьютера с использованием табличного редактора Excel 2016 с помощью пакетов прикладных программ Statistica 6.0.

Статистическую значимость (достоверность) различий по количественным переменным определяли путем вычисления t-критерия Стьюдента при параметрическом распределении данных. Изменения считались статистически значимыми (достоверными) при P<0,05 [12–14].

Результаты и обсуждение

Результаты морфологического исследования лейкоцитов в условиях высокогорья в сочетании с холодом отражены в Таблице.

Ранее было показано, что у крыс при адаптации к условиям высокогорья показатели объемной плотности митохондрий к третьему дню адаптации значимо увеличивались в нейтрофилах, моноцитах и эозинофилах [15].

Таблица

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ КЛЕТОК КРОВИ КРЫС ПРИ АДАПТАЦИИ К УСЛОВИЯМ ВЫСОКОГОРЬЯ В СОЧЕТАНИИ

С ХОЛОДОМ ПРИ t +4°С (M±m, объемная плотность в %)

Показатели	Контрольная группа 1 г	Сроки адаптации к высокогорью
		руппа (3 сутки)	2 группа (30 сутки)
Нейтрофилы
Митохондрии	0,6±0,01	1,2±0,01*	1,7±0,01**#
Рибосомы	0,9±0,01	1,6±0,01*	2,6±0,01**#
Вакуоли	0,4±0,01	4,3±0,01*	1,4±0,01**#
Лизосомы	7,1±0,01	8,9±0,01*	9,6±0,01**#
Спец. гранулы	21,3±0,01	13,1±0,2*	21,2±0,4#
Эозинофилы
Митохондрии	1,1±0,01	1,6±0,01*	1,9±0,01**#
Рибосомы	1,3±0,01	1,3±0,01*	2,9±0,01**#
Вакуоли	0,3±0,01	1,7±0,01*	0,8±0,01**#
Спец. гранулы	21±0,3	10,0±0,3*	21,0±0,4#
Моноциты
Митохондрии	2,6±0,01	3,6±0,3*	5,2±0,2**#
Рибосомы	2,3±0,01	2,8±0,1*	4,6±0,4**#
Вакуоли	0,6±0,01	1,3±0,02*	0,8±0,01**#
Лизосомы	12,1±1,7	14,0±0,2*	17±0,03**#
Средние лимфоциты
Митохондрии	1,9±0,01	2,8±0,01*	4,7±0,02**#
Рибосомы	1,6±0,01	1,6±0,04	5,2±0,01**#
Вакуоли	0,4±0,01	1,2±0,01*	0,6±0,01**#
Лизосомы	0,9±0,02	0,7±0,01*	0,9±0,01#
Примечание: * —	р < 0,05 при сравнении 1 группы с	контролем; ** —	р < 0,05 при сравнении

2 группы с контролем; # — р < 0,05 при сравнении 2 группы с 1 группой.

Такая же тенденция наблюдалась и у крыс при адаптации к условиям высокогорья с сочетанием холодом: на 3 сутки уровень объемной плотности митохондрий повышался почти в 2 раза в нейтрофилах, в 1,5 в эозинофилах и в 1,4 раза в моноцитах и средних лимфоцитах. С увеличением срока пребывания в высокогорье в сочетании с холодовым воздействием объемная плотность митохондрий продолжала возрастать во всех видах клеток белой крови, и на 30-е сутки адаптации была статистически значимо выше и в сравнении с контролем, и в сравнении с показателями группы животных на 3 сутки адаптации. Эти данные еще раз подчеркивают важнейшую роль митохондрий, как одного из основных регуляторов энергетического обмена в ответе организма на действие стрессовых факторов.

Анализ показателей морфометрии клеток белой крови выявил также статистически значимое увеличение объемной плотности рибосом на 3 сутки адаптации к высокогорью в сочетании с холодом в нейтрофилах, эозинофилах и лимфоцитах (Рисунок 1).

Так, показатели объемной плотности рибосом возросли от 0,9±0,014 до 1,6±0,017 (р < 0,01) в нейтрофилах и от 2,3±0,011 до 2,8±0,1 (р < 0,05) в моноцитах. Причем, на 30 сутки адаптации к высокогорной гипоксии в сочетании с воздействием холода, объемная плотность рибосом продолжал возрастать: в нейтрофилах с 0,9±0,014 до 2,6±0,017 (р < 0,001), в эозинофилах от 1,3±0,014 до 2,9±0,011 (р < 0,01), в моноцитах от 2,3±0,011 до 4,6±0,4 (р < 0,01), в лимфоцитах от 1,6±0,011 до 5,2±0,01 (р < 0,001).

Такая же тенденция к увеличению объемной плотности была отмечена и у вакуолей клеток (Рисунок 2).

Рисунок 1. Средний лимфоцит крысы на 30 сутки адаптации в сочетании с холодом. В цитоплазме видны митохондрии и большое количество рибосом. Ядро с конденсированным и диффузным хроматином. Ув. ×10000

Рисунок 2. Нейтрофильный лейкоцит крысы на 3 сутки адаптации к условиям высокогорья в сочетании с холодом. В цитоплазме среди первичных и вторичных гранул видны многочисленные электроннопрозрачные вакуоли. Ув. ×20000

В этом случае на 3 сутки адаптации было зафиксировано возрастание показателя объемной плотности вакуолей по сравнению с контролем у нейтрофилов с 0,4±0,013 до 4,6±0,011 при р <0,05, в эозинофилах — с 0,3±0,011 до1,3±0,011 при р <0,05, в моноцитах с 0,6±0,013 до 0,9±0,011 при р <0,05. Повышение объемной плотности вакуолей объясняется тем, что идет процесс увеличения деления клеток и в связи с этим идет увеличение снабжения клеточной мембраны липидами, высвобождение различных соединений из клетки. Это могут быть гормоны или нейромедиаторы, белки и другие макромолекулы. К 30 дню адаптации объемная плотность вакуолей по сравнению с животными на 3 день адаптации статистически значимо снижалась, хотя так и не достигала показателей животных контрольной группы.

Динамика морфометрических показателей лизосом была следующей: в нейтрофилах и моноцитах объемная плотность лизосом к 3 суткам увеличивалась и продолжала возрастать к 30 суткам адаптации. В лимфоцитах этот показатель к 3 дню адаптации уменьшился с 0,9±0,017 до 0,8±0,014 при р <0,05, а к 30 дню адаптации сравнялся с показателями животных контрольной группы.

Особенно выраженные изменения при адаптации к условиям высокогорья в сочетании холодом были выявлены в отношении специфических гранул. Так, на 3 сутки наблюдения объемная плотность специфических гранул нейтрофилов по сравнению с контролем снизилась почти на 100% — с 21,3±0,014 до 13,1±0,2 при р <0,001, а у эозинофилов от 21±0,3 до 10,0±0,3 при р <0,001. Как известно, специфические гранулы содержат белки, которые обладают бактерицидным свойством.

Также в специфических гранулах содержится фермент NADPH-оксидаза. Этот фермент регулирует образование активных форм кислорода, за счет которых и реализуется бактерицидная функция специфических гранул. Снижение объемной плотности специфических гранул свидетельствует о значительном снижении сопротивляемости организма в период аварийной адаптации к гипоксии и холоду. К 30 суткам пребывания в условиях высокогорья в сочетании с холодом показатель объемной плотности специфических гранул в нейтрофилах и эозинофилах практически сравнялся с показателями животных контрольной группы.

Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что морфологическим отражением функциональной активности клеток белой крови под воздействием факторов высокогорья в сочетании с холодовым воздействием являются повышение объемной плотности митохондрий, рибосом и вакуолей и снижение объемной плотности специфических гранул.