Влияние экзополисахаридов молочнокислых бактерий на некоторые гематологические показатели крыс при моделировании ожога

В последние годы полисахариды все шире находят применение в фармацевтической промышленности, ветеринарии, медицине [Мизина,

2000; Онищенко и др., 2002; Способ …, 2009; Широбоков, 2015]. Имеются немногочисленные сведения о применении полисахаридов при заживле-

нии ожоговых ран [Способ …, 2009; Широбоков, 2015], однако среди них отсутствуют сведения о полисахаридах бактериального происхождения. Известно, что любой патологический процесс, который сопутствует, в том числе, и ожоговым ранам, отражается на количественных и качественных особенностях состава циркулирующей крови. Так, продукция лейкоцитов в костном мозге возрастает в ответ на любое повреждение тканей, это часть нормального воспалительного ответа [Шано, Черний, Нестеренко, 2001]. В связи с этим исследование полисахаридов на некоторые показатели крови представляется важной и интересной задачей.

Цель исследований – изучить влияние ЭПС молочнокислых бактерий Lactococcus lactis В-1662 и Streptococcus thermophilus на некоторые гематологические показатели, в частности, лейкоциты.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования явились ЭПС, выделенные нами ранее [Фокина, Урядова, Карпунина, 2016, 2018] из культур: Lactococcus lactis В-1662, полученной из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино) и Streptococcus thermophilus , полученной из ФГБНУ Всероссийского научноисследовательского института молочной промышленности (г. Москва), а также коммерческий препарат – 5%-ный декспантенол в форме крема («Пантодерм», АО «АКРИХИН», Россия).

Исследование проводили на белых беспородных крысах-самках массой 270 - 300 г, прошедших карантин в течение 14 сут. Крысы находились в виварии при одинаковых условиях содержания и кормления. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных»), требованиями Федерального закона от 01.12.1999 г. «О защите животных от жестокого обращения» и положениями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18.03.1986 г.). За сутки до эксперимента крысы были про-депилированы путем выщипывания обозначенной для ожога поверхности. Для проведения эксперимента крысы были разделены на 5 групп (n=6): группа 1 – контрольные животные (без ожога), группа 2 – контрольные животные, у которых вызывали ожог, группа 3 – контрольные животные, у которых вызывали ожог и после ожога наносили коммерческий препарат 5%-ный декспантенол, группа 4 – опытные животные, которым после ожога наносили 0.6%-ный раствор ЭПС L. lactis B-

1662, группа 5 – опытные животные, которым после ожога наносили 0.6%-ный раствор ЭПС S. thermophilus. Моделирование ожога проводили под эфирным наркозом на межлопаточном пространстве крысы дном пробирки площадью – 2×2 см² с кипящей водой (2/3 объема) [Пономарь, 2012] в течение 30 сек. для формирования ожога степени IIIа. Нанесение 5%-ного декспантенола и бактериальных ЭПС проводили сразу же после нанесения ожога и далее ежедневно в течение 28 сут. эксперимента. Определение относительного количества (процентного содержания) лейкоцитов крови крыс проводили через 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28 сут. Для дифференциального подсчета лейкоцитов давали визуальную микроскопическую оценку сухих фиксированных окрашенных мазков крови по Романовскому-Гимза [Никитин, 1949]. Лейкоциты подсчитывали по методу зигзага (по линии «Меандра») [Никитин, 1949]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel» и «Statis-tica 5.0». Достоверность различий определяли методом парных сравнений по t-критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

В работе изучали влияние ЭПС L. lactis B-1662 и S. thermophilus, обладающих антимикробными, иммуномодулирующими, ранозаживляющими свойствами [Урядова, Фокина, Карпунина, 2017; Урядова и др., 2018], на различные формы лейкоцитов – лей-кограмму (эозинофилы, нейтрофилы, лимфоциты, моноциты). Было показано, что процессы заживления в опытных и контрольных группах существенно отличались. Заживление интенсивнее протекало в группах, где применяли ЭПС, особенно в группе 5, где после ожога крысам наносили 0.6%-ный раствор ЭПС S. thermophilus [Урядова и др., 2018а]. Влияние исследуемых ЭПС на кроветворную функцию отмечалось с самого начала обработки крыс этими биополимерами. Аналогичную картину наблюдали в группе 3, где для обработки ран применяли 5%-ный декс-пантенол. Как видно из таблицы, с первых суток во всех группах, кроме первой, наблюдали значительное увеличение количества нейтрофилов, т.е. наблюдали реактивную нейтрофилию (регенеративный сдвиг ядра влево), частой причиной которого являются бактериальные инфекции, сопровождающие ожоги. Известно [Черний, Нестеренко, 2007], что высокий нейтрофильный лейкоцитоз при воспалительных заболеваниях развивается при воздействии на костный мозг интерлейкинов, в том числе ИЛ-1 и фактора некроза опухоли (ФНО-α). Нами ранее [Урядова и др., 2018] также было показано, что под действием ЭПС L. lactis B-1662 и S. thermophilus продукция этих цитокинов увеличивалась. Наличие юных нейтрофилов через 1 и 3 сут. в группах, где применяли ЭПС, свидетельствовало об усилении их продукции кост- ные инфекции.

ным мозгом, как самый первый ответ на бактериаль-

Воздействие экзополисахаридов молочнокислых бактерий при заживлении ожогов на лейкограмму крыс

Примечание. р ≤ 0.05 ▪ относительно 1 группы (контроля без ожога); * относительно показателя в своей же группе в 1 сутки.

На 21-е сутки наблюдали снижение уровня нейтрофилов до значений интактной (1) группы, что свидетельствовало об окончании воспалительного процесса, поскольку известно, что сегментоядерные нейтрофилы, будучи микрофагами, играют роль в защите организма от бактериальных инфекций – спутников ожоговых ранений [Черний, Нестеренко, 2007; Галимзянов, 2012; Рожкова,

Теплый, Фельдман, 2015]. На 28-е сутки количество нейтрофилов было сопоставимо с количеством этой формы лейкоцитов в интактной группе животных.

При определении эозинофилов в 1-е сутки наблюдали резкое понижение их числа (относительная анэозинопения) в 2-, 3-, 4-, 5-й группах. Через 5 суток их число возрастало в группе 5 (ожог

+ ЭПС S. thermophilus ), как и число моноцитов, а через 7 сут. их количество увеличивалось и во 2-, 3-, 4-й группах. Главная задача моноцитов и нейтрофилов заключается в защите организма от микробов и злокачественных клеток, удалении чужеродных и отмерших частиц за счет выделения протеолитических ферментов, адсорбции на своей поверхности и переносе веществ, обезвреживающих микроорганизмы [Никитин, 1949; Черний, Нестеренко, 2007]. Из ряда работ известно [Чер-ний, Нестеренко, 2007; Шапошников и др., 2015; Ажикова, Журавлева, 2016] о том, что эозинофилия характерна при ожоговой болезни. Повышение числа эозинофилов подтверждается данными, полученными нами ранее об увеличении числа макрофагов под действием изучаемых ЭПС [Урядова и др., 2018]. Также можно отметить, что увеличение числа моноцитов-макрофагов стимулирует фактор, вызывающий некроз опухоли, обладающий цитотоксическим и цитостатическим эффектами на опухолевые клетки, что подтверждается нашими исследованиями о стимуляции ЭПС синтеза ФНО-α [Урядова и др., 2018]. Наиболее выраженное влияние на увеличение доли эозинофилов и моноцитов, как видно из таблицы, оказал ЭПС S. thermophilus .

При определении концентрации лимфоцитов отмечали их снижение в крови крыс сразу же в 1-е сут. после моделирования ожога. Их число начинало восстанавливаться через 3-е сут. во всех группах. В группах 3, 4, 5 число лимфоцитов достигло физиологической нормы на 10-е сут. по сравнению с группой 2, где их число нормализовалось только к 14-м сут.

В группах 3, 4, 5 с применением исследуемых бактериальных ЭПС и коммерческого препарата (5%-ный декспантенол), процентное содержание лейкоцитов восстановилось до физиологической нормы раньше (через 10 сут.), чем в группе 2 без лечения, где их число нормализовалось только к 14-м сут. Изменений в морфологии лейкоцитов крови животных групп 4 и 5 по сравнению с показателями животных в 1-, 2-, 3-ей группах на протяжении эксперимента, установлено не было. За время наблюдения у животных всех групп нарушений функций пищеварения и мочеотделения отмечено не было, гибели крыс в ходе эксперимента также не установлено.

Заключение

Таким образом, результаты лейкограммы свидетельствуют о том, что ЭПС Lactococcus lactis В-1662 и Streptococcus thermophilus, оказывают влияние на кроветворение, стимулируя ускорение завершения инфекционного процесса. Наиболее выраженный эффект исследуемые ЭПС оказывали на эозинофилы, моноциты, сегментоядерные нейтро- филы и лимфоциты по сравнению с группой 2 без лечения; при этом, судя по увеличению доли моноцитов и эознофилов, скорейшее завершение инфекционного процесса наблюдали в группе животных, где применяли ЭПС S. thermophilus. Наблюдаемые в ходе эксперимента лимфоцитоз и повышение уровня нейтрофилов характерны для ожоговых ранений, сопровождающихся бактериальными инфекциями. Отмеченные изменения в процентном составе лимфоцитов при применении данных ЭПС сопоставимы с данными, полученными при использовании 5%-ного декспантенола, но, как было показано нами ранее [Урядова, Фокина, Карпунина, 2018], ЭПС L. lactis В-1662 и S. thermophilus способствовали более быстрому заживлению ран по сравнению с результатом от применения коммерческого препарата, и это в перспективе может найти применение в медицине и ветеринарной практике.