Влияние электростимуляции на содержание pAkt в клеточной культуре миоцитов в условиях гипергликемии

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ / EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS

the authors do not declare a conflict of interest the reported study was funded by RSF according to the research project No. 19-15-00118,

Dyakova E.Y., Chernykh A.E., Milovanova K.G., Chibalin A.V., Kapilevich L.V. Effect of electrical stimulation on the content of pAkt in myocyte cell culture under hyperglycemia. The Siberian Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2023;38(1):106–109. https://doi. org/10.29001/2073-8552-2023-38-1-106-1009.

Проблемы исследования молекулярных механизмов патогенеза, инсулинорезистентности и поиска новых путей их коррекции по-прежнему остаются актуальными, так как эти состояния оказывают существенное влияние на качество и продолжительность жизни человека, во многом определяют процессы здорового старения и работоспособности в старшем возрасте [1]. Особый интерес вызывают позитивные эффекты физических нагрузок, которые способствуют снижению инсулинорезистентности и восстановлению способности мышечных клеток утилизировать глюкозу [2]. Однако механизмы реализации этого эффекта до настоящего времени остаются дискуссионными. Перспективным путем их изучения являются эксперименты на клеточных культурах [3, 4].

Цель: изучить влияние электростимуляции на содержание pAkt в клеточной культуре миобластов мыши С2С12, культивируемых в условиях гипергликемии.

Материал и методы

Работа выполнялась на клеточной культуре миобластов мыши С2С12 (источник – коллекция клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки высевались с плотностью 3 × 104 клеток/лунку в 16 шестилуночных планшетов, содержащих среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), с добавлением 5 мМ глюкозы, 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 единиц/мл пенициллина. и 100 мкг/мл стрептомицина и хранили при 37 °С в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Через 3–5 дней после посева, когда клетки достигали 70–80% конфлюэнтности, они подвергались дифференцировке в среде DMEM, содержащей 5 мМ глюкозы, антибиотики, 2% телячью сыворотку и 1 нМ инсулин. Среду дифференцировки меняли ежедневно. Морфологию клеток оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии при увеличении х 400 без предварительной фиксации.

После окончания дифференцировки планшеты с клетками случайным образом разделялись на две группы – экспериментальную (ЭГ, 48 лунок) и контрольную (КГ, 48 лунок). В планшетах ЭГ заменяли дифференцировочную среду с 5,5 мМ глюкозы на среду, содержащую 25 мМ глюкозы. В планшетах КГ в среду с 5,5 мМ глюкозы до- бавляли маннитол для уравнивания осмолярности. Клетки помещались на 2 дня в инкубатор.

Далее клетки подвергали электростимуляции (которую мы рассматривали как моделирование физической нагрузки). Для того чтобы привести все клетки к состоянию базальной активности, в каждой группе проводили метод serum starvation – сывороточное голодание [5]. Для этого клетки на 1 ч помещались в среду, не содержащую сыворотки, после этого среда заменялась на сывороточную.

Каждая группа разделялась на 4 подгруппы по 12 лунок. Одна подгруппа в каждой группе оставалась интактной, а три – подвергались воздействию электроимпуль-сной стимуляции в течение 2, 6 и 24 ч соответственно. Электроимпульсная стимуляция выполнялась с использованием генератора импульсов C-Pace (C-Pace EP, IonOptix, США) с напряжением 40 В, длительностью стимулов 10 мс и частотой 1 Гц.

Сразу после завершения электростимуляции в 6 лунок в каждой подгруппе добавляли 10 нм инсулина, а в 6 лунок – аналогичное количество сыворотки, после чего планшеты помещали в инкубатор на 30 мин, затем клетки промывали PBS и замораживали в жидком азоте. Материал хранили в морозильной камере при температуре –80 оC.

Клеточные лизаты получали солюбилизацией клеточных преципитатов в 1 x PBS (pH 7,4) и повторным замораживанием и плавлением. Концентрацию белка определяли с помощью метода Лоури. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле проводили в соответствии с методом Лэммли с 5% стекирующим гелем и 12% бегущим гелем. Белки переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, США) с последующим блокированием 5% сухим молоком (Valio, Финляндия) в 1 x PBST (PBS с добавлением Tween 20 0,1%) в течение 1 ч при комнатной температуре. Обнаружение скелетного тропо-нина-Т с использованием инкубации в течение ночи с 10 мкг/мл антител к тропонину-Т каждое при 4 °С в 5% сухом молоке в PBST. Инкубацию с вторичными антителами, конъюгированными с HRP, проводили в течение 1 ч при комнатной температуре в 5% сухом молоке в PBST. Визуализацию комплексов антиген-антитело осуществляли с помощью набора ECL и ChemiDoc XRS + Molecular Imager (BioRad, США).

Для контроля состояния глюкозтранспортирующих систем определяли содержание фосфорилированной формы протеинкиназы pAkT. Определение выполняли методом вестерн-блот с применением специфических антител anti-pAkT (ser427).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета статистического анализа STATISTICA 8.0. Нормальность распределения показателя в сравниваемых группах оценивали по критерию Шапиро – Уилка. Так как гипотеза о нормальности распределения показателей не подтверждалась, концентрации белка pAkt в подгруппах представлены медианами ( Ме ) и межквартильными интервалами ( Q₁; Q₃ ), а для проверки гипотезы об отсутствии различий в независимых подгруппах использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Различия считали значимыми при достигнутом уровне значимости p <  0,05.

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Биологического института ТГУ (протокол № 32 от 02 декабря 2019 г.).

Результаты

Белок pAkt обнаруживался во всех исследуемых образцах. В ЭГ его содержание было ниже, чем в КГ. Добавление инсулина приводило к достоверному увеличению содержания pAkt в обеих группах, однако в КГ прирост был значительно выше, чем в ЭГ (таблица). Очевидно, что в данной модели инсулинорезистентность формируется лишь частично.

После 2-часовой электроимпульсной стимуляции наблюдалось некоторое увеличение содержания pAkt в обеих группах. После добавления инсулина прирост фосфорилированной формы фермента был выше, чем в подгруппе без стимуляции, особенно существенный прирост отмечался в ЭГ. После 6-часовой электроимпульсной стимуляции прирост содержания pAkt был более выражен, чем после 2 ч. Однако после 24-часовой электро-импульсной стимуляции мы наблюдали значительное снижение прироста содержания pAkt во всех подгруппах клеток. Возрастание содержания pAkt при добавлении инсулина наблюдалось и в ЭГ, и в КГ в равной степени.

Таблица. Содержание рAkt в образцах гомогенизированных миоцитов после воздействия электростимуляции

Table. pAkt content in samples of homogenized myocytes after electrical stimulation

Стимуляция Stimulation	Предобработка Pretreatment	Группы (Groups) Me ( Q 1 ; Q3 )
		Контрольная Control	Экспериментальная Experimental
Без стимуляции Without stimulation	Интактные Intact	261 (229; 295)	155 (127; 179)*
	Инсулин Insulin	1512 (1458; 1577)#	692 (655; 738)*#
2 ч (2 hours)	Интактные Intact	499 (462; 439)	611 (668; 741)*
	Инсулин Insulin	1855 (1764; 1929)#	1452 (1399; 1507)*#

Окончание табл. End of table

Стимуляция Stimulation	Предобработка Pretreatment	Группы (Groups) Me ( Q 1 ; Q3 )
		Контрольная Control	Экспериментальная Experimental
6 ч (6 hours)	Интактные Intact	611 (571; 559)	799 (755; 8420)*
	Инсулин Insulin	2145 (2033; 2227)#	2120 (2048; 2204)#
24 ч (24 hours)	Интактные Intact	428 (381; 484)	497 (448; 562)
	Инсулин Insulin	1045 (989; 1112)#	981 (931; 1039)#

Примечание: * – достоверность различий между экспериментальной и контрольной группой, p <  0,05; # – достоверность различий между интактными клетками и клетками, стимулированными инсулином, p <  0,05.

Note: * – significance of differences between the experimental and control groups, p <  0.05; # – significance of differences between intact cells and cells stimulated by insulin, p <  0.05.

Таким образом, культивирование миобластов С2С12 в среде с избытком глюкозы сопровождается снижением содержания p-Akt в клетках, тогда как импульсная электростимуляция от 2 до 6 ч способствует увеличению содержания данного фермента и восстановлению чувствительности путей его фосфорилирования к воздействию инсулина.

Обсуждение

Акt представляет собой серин- или треонинкиназу. Akt играет решающую роль в развитии инсулинорезистентно-сти мышечной и жировой ткани, регулируя стимулированный инсулином перенос GLUT4, изменения активности Akt обнаруживаются в различных клетках при диабете и инсулинорезистентности. Фосфорилирование Akt снижается в адипоцитах и скелетных мышцах пациентов с сахарным диабетом 2-го типа. В адипоцитах активация Akt2 тесно коррелирует с транслокацией GLUT4 посредством активирования инсулином [6, 7]. У мышей с нокаутом Akt2 или Akt3, но не Akt1, развивается диабет с гипергликемией, гиперинсулинемией, нарушениями транспорта и поглощения глюкозы в мышцах [6].

Заключение

Полученные результаты позволяют предположить, что сократительная активность мышечных клеток способствует восстановлению чувствительности клеток к инсулину и способности поглощать глюкозу, задействуя те же регуляторные и транспортные пути, которые страдают при развитии сахарного диабета 2-го типа. Эти данные могут быть особенно полезны в широкой области исследований молекулярного механизма поглощения глюкозы миоцитами, резистентности к инсулину, диабета и ожирения.