Влияние композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана на сокращение гладкомышечных клеток воротной вены крыс

Дигидрокверцетин (ДГК) – известный флавоноид, обладающий противовоспалительными, противоотечны-ми, ангиопротекторными и другими свойствами, делающими его перспективным для разработки флебопротек-торного средства [1]. Ранее было показано, что ДГК не оказывает прямого влияния на тонус изолированной воротной вены, но снижает амплитуду ее сократительного ответа на КCl и норадреналин [3]. С другой стороны, расслабляющий эффект на сосуды у ДГК меньше в сравнении с большинством других флавоноидов [11].

В недавних экспериментах была показана возможность модулирования фармакологических эффектов ДГК, благодаря использованию его в композиции с арабиногалактаном (АГ) [4]. Цель работы: оценить влияние ДГК, АГ и их композиции на сокращение ГМК воротной вены крыс.

Материал и методы

В работе использовали ДГК (98,6%) и АГ (98,7%), выделенные из древесины лиственницы даурской (Larix dahurica Turcz.), а также композицию ДГК и АГ в соотношении 1:5 (содержание ДГК и АГ 14,9% и 80,1% соответственно). Субстанции для исследования предоставлены ЗАО “Аметис”.

Эксперименты выполнены на 24 аутбредных крысах самцах Вистар массой 300–350 г, полученных из вивария ФГБУ “НИИ фармакологии им. Е.Д. Гольдберга” СО РАМН. Животные содержались в пластиковых клетках в стандартных условиях с 12/12 световым циклом и свободным доступом к воде и пище. Крысы подвергались эвтаназии ингаляцией СО2. Затем брюшную полость вскрывали, выделяли фрагмент воротной вены длиной 2–3 см, очищали его от жира и соединительной ткани и промывали в растворе Кребса (NaCl – 120,4 мМ; КCl – 5,4 мМ; CaCl2– 2,5 мМ; MgCl2–1,2 мМ; KH2PO4– 0,6 мМ; трис-гидроксиаминометан – 15,5 мМ; глюкоза – 5,5 мМ; рН=7,44) при 25 oС. В работе использовали фрагменты вены в виде колец шириной 2 мм, которые помещали между фиксированным на дне камеры штоком и крючком, соединенным с датчиком силы (FT10g AD Instrument, Ukraine). Для записи миограммы использовался персональный компьютер с 14-битным АЦП L791 (Л-Кард, Москва).

После закрепления фрагмента воротной вены в камере с термостатируемым раствором Кребса (35,0±1,0 °С) производили его растяжение нагрузкой 250–300 мг и оставляли в течение 45 мин для полной стабилизации. Каждые 15 мин производили смену раствора. Перед тестированием исследуемых веществ трехкратно проверяли реакцию сосуда на введение 40 мМ КCl. Для оценки влияния исследуемых субстанций на сокращение ГМК проводили 20-минутную преинкубацию с веществами в следующих концентрациях: ДГК – 0,001%, АГ – 0,005%, композиция ДГК и АГ в соотношении 1:5 – 0,006%. После периода преинкубации индуцировали сокращение ГМК добавлением КCl (40 мМ) или фенилэфрина (ФЭ, 10–5 М). Исходные амплитуды сокращений приняты за 100%: в первом случае – реакция сосуда на КCl, во втором – реакция сосуда на ФЭ.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ “STATISTICA 6.0”, достоверность полученных результатов оценивали по непараметрическому критерию Манна–Уитни. Данные представлены в виде

Таблица 1

Влияние дигидрокверцетина (0,001%), арабиногалактана (0,005%) и их композиции (0,006%) на амплитуду сокращения, вызванного KCl (40 мМ)

Группы	Амплитуда сокращения, %
Дигидрокверцетин, n=8	61,0±5,2
Арабиногалактан, n=8	124,5±6,6*
Композиция дигидрокверцетина и арабиногалактана, n=8	92,0±6,5*+

Примечание: * – р<0,01 по сравнению с дигидрокверцетином, + – р<0,05 по сравнению с арабиногалактаном.

M±m, где M – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего значения.

Результаты

Исследованные вещества в используемых концентрациях сами по себе не индуцировали сокращение ГМК изолированного сегмента воротной вены крыс.

В концентрации 0,001% ДГК оказывал ингибирующий эффект на сокращение ГМК, индуцированное 40 мМ КCl (табл. 1). Амплитуда сокращения снижалась на 39% относительно контроля. Добавление 0,005% АГ, напротив, приводило к достоверному повышению амплитуды гиперкалиевого сокращения на 24%. При использовании композиции ДГК и АГ амплитуда сокращений была достоверно больше на 31% по сравнению с показателями, полученными при инкубации с ДГК в отдельности.

При исследовании влияния ДГК, АГ и их композиции на сокращение ГМК воротной вены крыс, индуцируемое ФЭ, было выявлено, что все исследуемые вещества оказывали выраженное ингибирующее влияние (табл. 2). Амплитуда сокращения после периода инкубации с ДГК снижалась на 70% по сравнению с исходной, с АГ – на 66%, с композицией ДГК и АГ – на 90%.

Обсуждение

Как известно, многие флавоноиды (кверцетин, кемпферол, нарингенин) ингибируют сократительный ответ гладких мышц сосудов на норадреналин, ФЭ, высокую концентрацию KCl и другие стимулы [5, 11].

Деполяризация клетки, вызванная добавлением избытка KCl, инициирует открытие потенциал-зависимых Са2+-каналов L-типа и развитие гиперкалиевой контрактуры. Было показано, что ряд флавоноидов (кверцетин, мирицетин) активируют Са2+-каналы L-типа [9]. При этом известно, что кверцетин, несмотря на активацию входа Са2+ внутрь клеток, оказывает угнетающее действие на сокращение гладких мышц сосудов [5, 8]. Поэтому наблюдаемое снижение амплитуды KCl-индуцированного сокращения после преинкубации с ДГК, возможно, обусловлено другими механизмами, связанными, например, с ингибированием внутриклеточных ферментов. Наблюдаемое повышение амплитуды гиперкалиевого сокращения на фоне АГ, возможно, связано со снижением калиевой проводимости мембраны. Интересно отметить, что использование ДГК в композиции с АГ позволяет снизить

Таблица 2

Влияние дигидрокверцетина (0,001%), арабиногалакта-на(0,005%) и их композиции (0,006%) на амплитуду сокращения, вызванного ФЭ (10–5М)

Группы, n=8	Амплитуда сокращения, %
Дигидрокверцетин	29,6±7,1
Арабиногалактан	34,0±7,2
Композиция дигидрокверцетина и арабиногалактана	9,4±3,8+

Примечание: + – р<0,05 по сравнению с арабиногалактаном.

угнетающий эффект ДГК на сокращение ГМК воротной вены крыс.

Сокращение ГМК в ответ на добавление катехоламинов вызвано активацией адренергических рецепторов, что приводит к снижению уровня цАМФ и увеличению концентрации Са²⁺ в цитоплазме ГМК [6]. Данные нашего предыдущего эксперимента свидетельствуют об уменьшении сократительного ответа ГМК воротной вены крыс на добавление норадреналина после преинкубации с ДГК [3]. В результате настоящего исследования установлено, что ДГК угнетает сократительный ответ гладких мышц вен на добавление ФЭ, который является агонистом α ₁-адренорецепторов. АГ также снижал амплитуду сокращений ГМК, а при использовании композиции двух веществ этот эффект суммировался.

Как известно, ферментом, разрушающим цАМФ, является цАМФ-зависимая фосфодиэстераза (ФДЭ). В исследованиях in vitro было показано, что кверцетин и некоторые другие флавоноиды ингибируют активность ФДЭ, а ДГК, напротив, увеличивает ее активность [7]. Учитывая этот факт, кажутся противоречивыми данные о способности ДГК повышать уровень циклических нуклеотидов и снижать концентрацию Са2+в цитоплазме тромбоцитов [2]. К сожалению, в литературе отсутствуют данные о влиянии ДГК на содержание цАМФ и Ca2+ в ГМК. С другой стороны, активность фосфодиэстеразы может не иметь определяющего значения в вазорелаксирующем действии флавоноидов, так как было показано, что повышение уровня цАМФ не изменяет кверцетин-индуциро-ваннное расслабление ГМК [5].

Помимо фосфодиэстеразы, важную роль в процессе сокращения играют протеинкиназы, фосфорилирующие белки сократительного аппарата и изменяющие, таким образом, их чувствительность к ионам Ca2+ [6]. Флавоноиды, в том числе и ДГК, ингибируют активность проте-инкиназы С и тем самым могут препятствовать увеличению Ca2+-чувствительности сократительных белков [8, 10].

Заключение

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об угнетающем действии дигидрокверцетина на сократительный ответ гладкомышечных клеток воротной вены крыс на действие различных стимулов (KCl, норадреналин, фенилэфрин). Использование ДГК в композиции с АГ позволяет снизить угнетающий эффект ДГК на KCl-индуцируемое сокращение гладкомышечных клеток воротной вены крыс. Все исследуемые вещества ингибируют сокращение ГМК, индуцируемое фенилэфрином.