Влияние композиций амилолитических ферментов на процесс низкотемпературной биоконверсии нативного крахмала

В настоящее время глубокая переработка крахмалсодержащего сырья и крахмала с получением продуктов высокого качества в широком ассортименте, конкурентоспособных и удовлетворяющих потребностям современного рынка, является одной из важнейших задач развития крахмалопаточной промышленности России.

Одним из актуальных направлений, ориентированных на разработку технологий переработки крахмала, способствующих расширению ассортимента крахмалопродуктов, востребованных в РФ, и их импортозамещению, является разработка новых эффективных методов модификации свойств нативного крахмала амилолитическими ферментами в процессе низкотемпературной биоконверсии в условиях, близких к промышленным.

Во ВНИИ крахмалопродуктов проведены исследования действия амилолитических ферментов на нативный крахмал в гетерогенной водной среде при температуре ниже начальной точки его клейстеризации и концентрациях сухих веществ крахмала в субстрате, близких к промышленным [1, 2]. Установлено, что при действии глюкоамилазы на нативный крахмал наибольшую атакуемость проявляют зерновые крахмалы, в частности кукурузный крахмал, наименьшую – картофельный. При этом в реакционной среде образуются следующие продукты: глюкозный сироп высокой доброкачественности с глюкозным эквивалентом ГЭ 98,5–99,0% и оставшийся негидролизованным крахмал с поврежденными гранулами, физикохимические и структурные свойства которого довольно существенно отличаются от нативного крахмала и позволяют считать его ферментативно модифицированным пористым крахмалом.

Поскольку активность глюкоамилазы в процессе биоконверсии крахмала зависит от свойств субстрата, скорость реакции может быть повышена за счет предварительного механического воздействия на нативный крахмал [3, 4]. Процесс биоконверсии крахмала также можно интенсифицировать путем создания композиций основного фермента-катализатора с сопутствующими амилазами, обладающих синергетическим эффектом при совместном действии [5–7].

Цель работы – исследование действия глюкоамилазы в композиции с другими амилолитическими ферментами в процессе низкотемпературной биоконверсии нативного крахмала в гетерогенной среде.

Объекты и методы исследований

Объектами исследований являлись: испытуемые ферментные препараты, исходный нативный крахмал и продукт его гидролиза – жидкая фракция (первичный фильтрат + промои). Катализаторами процесса биоконверсии в составе композиций были выбраны коммерческие препараты амилолитических ферментов: очищенной глюкоамилазы Optidex L-400 (продуцент – Asp. niger), пуллуланазы Optimax L-1000 (продуцент – Bac. licheniformis), комплексный препарат глюкоамилазы и пуллу-ланзы Optimax 7525 HP и препарат термостабильной α-амилазы Spezyme XTRA (продуцент – Bac. licheniformis), предоставленные компанией Du Pont (США), как обладающие близкими оптимальными условиями действия на крахмал в процессе биоконверсии. Амилолитические активности испытуемых ферментных препаратов определяли методами, изложенными в ГОСТ 54330–2011, пуллуланазную активность устанавливали по данным фирмы производителя. Количество и углеводный состав растворимых сухих веществ (СВ) крахмала определяли жидкостной хроматографией на анализаторе углеводов с рефрактометрическим датчиком фирмы Bischoff, модель 8120 и рефрактометре ИРФ-454Б2М. Результаты процесса биоконверсии оценивали путем определения степени растворения (СРК) и степени гидролиза крахмала (СГК) по разработанной во ВНИИ крахмалопродуктов методике [8].

Экспериментальные исследования проводились по ранее разработанной схеме, включающей следующие стадии:

─ приготовление водной суспензии крахмала с концентрацией СВ = 32%, доведение рН до требуемого значения, установка колб на платформу термошейкера-инкубатора IKA KS 4000i (Германия);

─ нагрев суспензии до 52 °С, внесение необходимых доз испытуемых ферментов, инкубирование приготовленной реакционной смеси при Т = 52 °С и постоянном перемешивании при 140 об/мин в течение 0–72 ч с периодическим отбором проб;

• ─    разделение проб реакционной смеси путем вакуум-фильтрования на жидкую фракцию – фильтрат и твердую – осадок с последующей промывкой осадка дистиллированной водой при гидромодуле 1:4;

• ─    смешивание фильтрата с промывными водами осадка;

─ высушивание осадка при температуре 25–50 °С до воздушно сухого состояния.

Во всех опытах в процессе биоконверсии количественно определяли распределение сухих веществ исходного крахмала на указанные фракции.

Результаты процесса биоконверсии оценивали путем определения степени растворения (СРК) и степени гидролиза крахмала (СГК) согласно методике, разработанной в ВНИИК [7], по формулам:

СРК = W pcb I ( W np x СВ рс ) (1)

где: W РСВ – масса СВ в водорастворимой фракции пробы, г; W пр – масса пробы, взятая на разделение, г; СВ рс – массовая доля СВ в реакционной смеси опыта, %.

СГК = ( СРК X ГЭ ) I 100 (2)

где: СРК – степень растворения крахмала, %; ГЭ – массовая доля редуцирующих веществ в пересчете на глюкозу в водорастворимой фракции, % – глюкозный эквивалент в настоящей работе согласно ГОСТ Р 52060–2003 «Патока крахмальная. Приложение Д» рассчитывали по данным углеводного состава, определенного методом ВЭЖХ, по формуле:

ГЭ = трв= 1,000 m_M + 0,580 щ.  ■

+ 0,395 т мтр + 0,180 m_8C

где: m гл , m мал , m мтр , m вс – массовая доля сахаров: глюкозы, мальтозы, мальтотриозы, высших сахаров в пересчете на сухое вещество, %; 1,000; 0,580; 0,395; 0,180 – усредненное значение коэффициентов для пересчета массовой доли сахаров на глюкозу.

Количество и углеводный состав растворимых сухих веществ (СВ) крахмала определяли методом ВЭЖХ на анализаторе углеводов с рефрактометрическим датчиком фирмы Bischoff, модель 8120, и рефрактометре марки ATR фирмы Schmidt (Германия).

Для определения показателей величины рН, сухого вещества и др. использовали методы техно-химического контроля производства крахмала и крахмалопродуктов.

Все результаты представлены как среднее не менее трех повторностей экспериментов с обеспечением доверительной вероятности не менее 95%.

Обсуждение результатов исследований

Первый этап исследований посвящен изучению влияния величины рН реакционной среды на действие глюкоамилазы Optidex L-400 (продуцент – Asp. niger ) в процессе биоконверсии при оптимальных параметрах температуры (52 °С) и концентрации суспензии нативного кукурузного крахмала (32%). Опыты проводили по разработанной схеме [2], для доведения рН суспензии крахмала использовали два варианта:

1 – доведение рН суспензии в пределах 3,0–5,5 осуществляли 16%-ным раствором НСl, 2 – использовали растворы ацетатных буферов с рН 3,0–5,5.

Результаты показали, что оптимальным значением рН для действия очищенной глюкоамилазы на нативный крахмал и в том, и в другом случае является величина рН 3,0–3,5, однако более эффективная динамика процесса наблюдается при доведении рН раствором НСl, обладающей каталитическими свойствами. Очевидно, что при одновременном действии глюкоамилазы и НСl в процессе биоконверсии повышение степени гидролиза объясняется синергетическим действием двух катализаторов до определенного рН субстрата (3,0–3,5). Дальнейшее снижение рН вызывает снижение активности глюкоамилазы

Далее исследовали действие глюкоамилазы на нативный крахмал в композиции с бактериальной альфа-амилазой Spezyme XTRA (продуцент – Bac. licheniformis ). Условия опытов: концентрация СВ в суспензии крахмала 32%, температура 52 °С, продолжительность биоконверсии 24 ч, величина рН субстрата 4,2 – оптимум для глюкоамилазы Optidex L-400 при действии на клейстеризованный крахмал и 3,3 – оптимум рН при биоконверсии нативного крахмала. Полученные результаты, представленные в таблице 1, показали, что при действии глюкоамилазы на нативный кукурузный крахмал в композиции с бактериальной альфа-амилазой наблюдается незначительное снижение степени растворения и гидролиза крахмала при увеличении дозировки альфа-амилазы по сравнению с контрольным опытом как при рН субстрата 4,2, так и при рН 3,3, что может быть следствием взаимного конкурентного ингибирования испытуемых ферментов.

Таблица 1

Результаты действия очищенной глюкоамилазы на нативный крахмал в присутствии бактериальной

альфа-амилазы

Table 1

The effect of the purified glucoamylase on native starch in the presence of bacterial alpha-amylase

№	рН субстрата Substrate рН	Дозировка ферментов, ед./г СВ Dosage of enzymes, DS unit/g		СВ фильтрата Filtrate DS	СРК, % DSS	ГЭ, % DE	СГК, % DHS
		ГлС GlS	АС AS
1	4,2	12	0,3	13,5	34,1	99,4	33,9
2	4,2	12	0,6	13,2	33,9	99,3	33,7
3	4,2	12	0,9	13,1	33,7	99,3	33,5
4	3,3	12	0,3	15,3	41,0	99,3	40,7
5	3,3	12	0,6	15,0	39,5	99,3	39,2
6	3,3	12	0,9	15,0	39,4	99,3	39,1
7	3,3	12	-	16,0	42,2	99,3	41,9

Следующая серия опытов проведена с целью изучения действия глюкоамилазы в композиции с пуллуланазой в оптимальных условиях (С = 32%, Т = 52 °С) и величине рН субстрата 4,2 и 3,3 ед. в течение 24 ч. В опытах использовали препараты глюкоамилазы Optidex L-400 и пуллуланазы Optimax L1000 компании Du Pont (США). Дозировка глюкоамилазы составляла 12 ед. ГлС/г СВ, активность пуллуланазы варьировали в пределах 0,4–1,2 ед. ASPU/г СВ. Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о влиянии дозировки пуллуланазы на совместное действие ее с глюкоамилазой на нативный крахмал в процессе низкотемпературной биоконверсии.

Таблица 2

Влияние дозы пуллуланазы ( Bac. licheniformis ) на процесс биоконверсии нативного крахмала в присутствии очищенной глюкоамилазы

Table 2

The influence of pullulanase ( Bac. licheniformis ) dose on the bioconversion process of native starch in the presence of purified glucoamylase

№ п/п	Дозировка ферментов Dosage of enzymes		СВ фильт-рата,% Filtrate DS,%	СРК, % DSS	ГЭ, % DE	СГК, % DHS
	Глюкоамилаза, ед. ГлС/г СВ крахмала Glucoamylase, unit GlS/g of starch DS	Пуллуланаза, ед. ASPU/г СВ крахмала Pullulanaza, unit of ASPU/g of starch DS
	рН субстрата – 4,2 | Substrаtе рН		– 4,2
1	12	0,4	13,9	35,6	99,2	35,3
2	12	0,8	13,6	34,0	99,2	33,7
3	12	1,2	13,0	32,3	99,2	32,0
4	12	-	13,9	33,7	99,3	33,5
рН субстрата – 3,3 Substrаtе рН – 3,3
5	12	0,4	16,8	41,7	99,2	41,4
6	12	0,8	16,4	40,8	99,2	40,5
7	12	1,2	15,6	38,9	99,2	38,6
8	12	-	16,0	38,5	99,2	38,2

При дозировке пуллуланазы 0,4 ед. ASPU/г СВ крахмала степень гидролиза превышает СГК контрольного опыта (без пуллуланазы) на 3,2%, что можно объяснить синергетическим действием композиции амилаз на нативный крахмал также, как на клейстеризованный [6, 7]. Однако увеличение дозировки пуллуланазы при заданных условиях приводит к снижению степени гидролиза. Исследования также показали, что для испытуемой композиции ферментов, так же как и для глюкоамилазы, оптимум рН находится в пределах 3,3–3,5.

Анализ данных по концентрации и углеводному составу растворимых СВ, полученных при биоконверсии крахмала в присутствии композиции глюкоамилазы с пуллуланазой в сравнении с таковыми, полученными ранее, при использовании одной глюкоамилазы в аналогичных условиях, показал, что эти показатели имеют практически равноценную зависимость от рН субстрата: содержание СВ фильтрата равномерно увеличивается в пределах рН 4,5→3,3 и снижается при рН 3,0, вероятно, вследствие частичной инактивации глюкоамилазы. На основании анализа сделан вывод о необходимости изучения действия пуллула-назы и используемой для доведения рН субстрата НСl на нативный крахмал в процессе его низкотемпературной биоконверсии в заданных условиях.

Влияние НСl на процесс биоконверсии нативного кукурузного крахмала при концентрации СВ в суспензии 32% и температуре инкубации 52 °С в течение 24 ч оценивали путем определения степени растворения крахмала (СРК), углеводного состава растворенных СВ и соответственно степени гидролиза (СГК), при варьировании рН исходной суспензии (рН – 6,4) в пределах 4,5–3,0 с интервалом 0,3 ед.

Результаты опытов, приведенные в таблице 3, показали, что снижение величины рН суспензии путем добавления раствора НСl до 3,6 и ниже вызывает некоторое повышение растворимости крахмала.

Таблица 3

Влияние рН суспензии на степень растворения и гидролиза кукурузного крахмала (инкубирование при 52 °С в течение 24 ч)

Table 3

The influence of the suspension рН on the degree of solubility and hydrolysis of corn starch (incubation at 52 °C for 24 h)

№ оп	СВ крахмала, г DS of starch, g	рН суспензии suspen-si-ons рН	Раство-ри-мые СВ, г Soluble DS, g	СРК, % DSS	ГЭ, % DE	СГК, % DHS	Углеводный состав РСВ, % Carbohydrate composition SDS,%
							Глюкоза glucose	ВМС HMS
1	23,76	6,4	0,04	0,15	0,00	0,00	0,0	0,0
2	48,11	4,5	0,08	0,17	0,18	0,03	0,0	100,0
3	48,13	4,2	0,08	0,17	0,18	0,03	0,0	100,0
4	48,13	3,9	0,08	0,17	0,18	0,03	0,0	100,0
5	48,17	3,6	0,09	0,18	0,18	0,03	0,0	100,0
6	48,20	3,3	0,09	0,20	0,23	0,05	5,26	94,74
7	48,00	3,0	0,13	0,27	0,26	0,07	6,82	93,18

Анализ углеводного состава растворимых СВ (РСВ) показал, что в раствор переходят высокомолекулярные сахариды и только при рН 3,3 появляются следовые количества глюкозы, что указывает на частичное расщепление гранул.

Оптимальные условия действия испытуемой пуллуланазы (препарат Optimax L 1000, продуцент – Bac. licheniformis) на клейстеризованный крахмал по данным производителя находятся на уровне рН 4,0–4,5, также как и глюкоамилазы Optidex L-400. Поскольку установлено, что оптимум действия испытуемой глюкоамилазы на нативный крахмал находится в пределах рН 3,0–3,5, опыты по изучению действия пуллуланазы на нативный крахмал в процессе низкотемпературной биоконверсии проводили при варьировании рН 32% -ной суспензии в пре- делах 4,5→3,3 с интервалом 0,3 ед. при температуре 52 °С и продолжительности инкубации 24 ч. Дозировка пуллуланазы составляла 10 ед. ASPU/г СВ крахмала. Действие пуллуланазы также оценивали по степени растворения крахмала, углеводному составу растворенных СВ и степени гидролиза.

Результаты проведенных опытов (таблица 4) показали, что в данных условиях процесса биоконверсии нативного кукурузного крахмала действие пуллуланазы при столь высокой дозировке (10 ед. ASPU/г СВ крахмала) вызывает растворение не более 1,0% СВ при оптимальном для фермента рН среды (4,2) при действии на клейстеризованный крахмал. При снижении рН степень растворения снижается очевидно в связи с частичной инактивацией фермента.

Таблица 4

Влияние рН суспензии на степень растворимости и гидролиза кукурузного крахмала при действии пуллуланазы

Table 4

The influence of the suspension рН on the degree of solubility and hydrolysis of corn starch under the action of pullulanase

№ оп.	СВ крахмала, г DS of starch, g	рН суспензии suspension рН	Растворимые СВ, г Soluble DS, g	СРК,% DSS,%	Углеводный состав РСВ,% Carbohydrate composition RSV,%				ГЭ,% DE,%	СГК,% DHS,%
					Г G	М M	МТ MT	ВМС HMS
1	48,0	4,5	0,43	0,92	44,80	13,50	12,00	29,70	62,43	0,57
2	48,0	4,2	0,45	0,94	44,81	13,60	11,87	29,72	62,76	0,59
3	48,0	3,9	0,43	0,90	44,83	13,25	12,40	29,52	62,68	0,56
4	48,0	3,6	0,38	0,80	45,28	13,40	12,02	29,30	63,16	0,50
5	46,5	3,3	0,34	0,74	45,30	12,40	12,00	29,30	62,50	0,46

Результаты анализа углеводного состава растворенных СВ крахмала позволяют предположить, что испытуемая пуллуланаза ( Bac. Licheni-formis ) наряду с α-1,6 – Д-гликозидными связями гидролизует и α-1,4 – Д-связи, на что указывает образование значительных количеств глюкозы (таблица 4) и относится к амилопуллуланазам-пуллуланазам II типа, гидролизующим наряду с α-1,6 – связями в пуллулане и разветвленных субстратах, α-1,4 – связи в полисахаридах, отличных от пуллулана (крахмал, амилопектин) [9–11].

Полученные данные и анализ большого числа публикаций работ отечественных и зарубежных исследователей посвященных проблеме получения, изучения свойств и применения пуллуланазы, свидетельствуют о важности проведения дальнейших исследований в направлении использования пуллуланазы в крахмалопаточной промышленности.

Заключение

Установлено, что при использовании в качестве катализатора процесса низкотемпературной биоконверсии нативного кукурузного крахмала композиции глюкоамилазы с термостабильной бактериальной альфа-амилазой, в отличие от клейстеризованного крахмала, не наблюдается позитивного эффекта. Данный факт обусловлен как несовместимостью оптимальных условий действия указанных ферментов, так и структурными свойствами нативного крахмала.

Проведенные исследования показали позитивное влияние на процесс биоконверсии нативного крахмала, аналогично действию на клейстеризованный крахмал, композиции