Влияние кондиционной повсеместной сверхэкспрессии генов репарации ДНК на устойчивость особей Drosophila melanogaster к действию стресс-факторов различной природы (оксидативному стрессу, тепловому шоку, голоданию)

Автор: Шилова Л.А., Плюснина Е.Н., Москалев А.А.

Журнал: Известия Коми научного центра УрО РАН @izvestia-komisc

Статья в выпуске: 2 (18), 2014 года.

Бесплатный доступ

Исследовано влияние кондиционной повсеместной сверхэкспрессии генов репарации ДНК, которые участвуют в распознавании повреждений ДНК ( Hus1, mnk), эксцизионной репарации ДНК ( mei-9, mus210, Rrp1 ) и репарации двуцепочечных разрывов ДНК ( Brca2, Ku80, spnB, WRNexo ) на устойчивость дрозофил к действию стресс-факторов различной природы - оксидативного стресса (20 µM параквата), теплового шока (35 оС) и голодания. Показано, что в большинстве случаев наличие в геноме дрозофил дополнительных активных копий генов репарации ДНК не стимулировало стрессоустойчивость особей, а, напротив, ухудшало ее. Полученные результаты также демонстрируют важную роль данных генов в обеспечении стрессоустойчивости целого организма.

Еще

Репарация днк, стрессоустойчивость, кондиционная повсеместная сверхэкспрессия

Короткий адрес: https://sciup.org/14992676

IDR: 14992676

Текст научной статьи Влияние кондиционной повсеместной сверхэкспрессии генов репарации ДНК на устойчивость особей Drosophila melanogaster к действию стресс-факторов различной природы (оксидативному стрессу, тепловому шоку, голоданию)

Все живые организмы подвергаются влиянию абиотических и антропогенных стрессоров и их жизнеспособность зависит от эффективности механизмов ответа на эти воздействия. Одним из наиболее важных механизмов ответа на стресс на молекулярно-клеточном уровне является распознавание и репарация повреждений ДНК. Известно, что мутации генов репарации ДНК значительно снижают устойчивость к действию повреждающих агентов [1]. Однако на данный момент имеется лишь небольшое количество сведений по влиянию сверхэкспрессии генов репарации ДНК на продолжительности жизни организмов. Например, введение в геном дрозофил 1-2 дополнительных копий гена mei-41 (гомолог ATR млекопитающих) приводит к увеличению продолжительности жизни по сравнению с особями дикого типа, однако значительного изменения в эффективности репарации ДНК у таких мух не происходит [2]. Сверхэкспрессия гена O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы в тканях мышей не приводит к увеличению продолжительности жизни [3]. Вероятно, это связано с тем фактом, что O6-метилгуанин не накапливается с возрастом, а потому не играет существенной роли в процессе старения [4].

Ранее нами было показано, что сверхэкспрессия гена ответа на повреждение ДНК D-GADD45 одновременно с увеличением медианной и максимальной продолжительности жизни повышает стрессоустойчивость особей Drosophila melano-gaster [5]. Цель данной работы – исследовать влияние сверхэкспрессии генов ответа на повреждение ДНК (гомологи HUS1, CHK2), генов эксцизионной репарации (гомологи XPF, XPC, AP-эндонуклеазы-1) и генов репарации двуцепочечных разрывов (BRCA2, KU80, WRNexo) на устойчивость особей Drosophila melanogaster к действию индуктора свободных радикалов параквата, гипертермии и голодания.

Материалы и методы

Для исследования стрессоустойчивости к различным повреждающим агентам использовали линии дрозофил, в геном которых встроены дополнительные копии исследуемых генов под контролем промотора UAS, индуцируемого драйвером GAL4: w¹¹¹⁸, UAS-Brca2; w¹¹¹⁸, UAS-Hus1; w¹¹¹⁸, UAS-mnk (Любезно предоставлены Dr. Schupbach, Princeton University, Princeton, США) , w¹¹¹⁸, UAS-Ku80; w¹¹¹⁸, UAS-mei-9; w¹¹¹⁸, UAS-mus210; w¹¹¹⁸, UAS-Rrp1; w¹¹¹⁸, UAS-WRNexo (Созданы с передачей авторских прав под заказ в Genetivision, Хьюстон, США) и линию P{Act5C(-FRT)GAL4.Switch. PR}3/TM6B, Tb¹ (далее – GS-GAL4 ) (Bloomington Stock Center, США).

Для сверхактивации генов репарации ДНК использовали RU486-активируемый GeneSwitch [6, 7]. Для получения особей дрозофил с кондиционной (мифепристон-индуцибельной) повсеместной сверхактивацией изучаемых генов, самцов линии GS-GAL4 , несущих активатор транскрипции GAL4 от дрожжей, скрещивали с виргинными самками, имеющими дополнительную копию исследуемого гена под контролем промотора UAS . При добавлении в корм потомкам скрещивания этих двух линий агониста прогестерона мифепристона (RU486) (Mifepritone, Sigma) активируется экспрессия GAL4, в результате чего запускается транскрипция генов под контролем промотора UAS . В качестве контроля использовали мух c тем же генотипом, живущих на питательной среде без добавления мифепристона.

Для определения устойчивости к оксидативно-му стрессу дрозофил рассаживали в банки с фильтровальной бумагой, пропитанной раствором 20 мМ параквата (Methyl Viologen, Sigma) в 5%-ной сахарозе. Для оценки устойчивости к тепловому шоку мух содержали при температуре 35 °С в банках со стандартной агарно-дрожжевой питательной средой. Для определения устойчивости к голоданию дрозофил помещали в банки с фильтровальной бумагой, пропитанной водой, объем выборок составил 110–120 мух на вариант эксперимента. Два раза в день подсчитывали количество умерших особей, после чего анализировали показатели выживаемости. Различия между выборками оценивали с помощью непараметрических критериев Колмогорова-Смирнова, Гехана-Бреслоу-Вилкоксона и φ-критерия Фишера для выборочных долей.

Результаты и обсуждение

Одним из главных повреждающих ДНК агентов являются активные формы кислорода. Их взаимодействие с ДНК приводит к образованию повре- ждений, включая модификации сахаров, разрывы цепей и аддукты оснований и сахара [8]. В большинстве случаев сверхэкспрессия генов репарации ДНК не приводила к достоверным изменениям, либо снижала среднюю длительность жизни самцов и самок в условиях действия индуктора свободных радикалов параквата на 7–30 % по сравнению с особями без сверхэкспрессии (p<0.05). Анализ других данных выживаемости показал аналогичный результат (таблица). Исключением являются самцы со сверхэкспрессией гена Mus210 (гомолог XPC) и самки с повышенной активностью гена Hus1 – их средняя продолжительность жизни в условиях окислительного стресса была выше на 15-36 % (p<0.05).

Основным типом повреждений при тепловом шоке являются повреждения белков, однако под его влиянием в результате увеличения темпов метаболизма и выработки свободных радикалов также происходит повреждение ДНК. Обнаружено, что повышенная транскрипция генов репарации ДНК для многих генов увеличила устойчивость дрозофил к гипертермии. Так, у самцов и самок со сверхэкспрессией генов Hus1 и WRNexo, самцов со сверхактивностью Brca2 и Rrp1 (гомолог AP-эндонуклеазы-1) , а также самок со сверхэкспрессией Mnk (гомолог CHK2) средняя продолжительность жизни при 35 °С была выше на 8-25 % по сравнению с контрольными особями (p<0.05). С другой стороны, увеличение транскрипции таких генов, как Ku80, Mei-9 (гомолог XPF) , Mus210 у самцов и Ku80, Brca2, Rrp1 у самок сопровождалось снижением средней длительности жизни на 8–24 % (p<0.05). Оценка других показателей выживаемости показала аналогичный результат (см. таблицу).

Чрезмерное снижение потребления пищи помимо прочих негативных эффектов также вызывает окислительный стресс и дефекты репарации ДНК [9]. Повышенная транскрипционная активность генов Brca2, Hus1, Mnk, WRNexo у самцов и гена Mus210 у самок привела к повышению средней длительности жизни в условиях голодания на 8–45 % (p<0.05). Анализ других показателей соответствовал этим данным. Однако сверхэкспрессия генов репарации ДНК в остальных вариантах эксперимента с воздействием голодания не повлияла на выживаемость, либо вызвала негативный эффект (таблица).

Таким образом, наиболее положительное влияние (повышение устойчивости к большинству исследуемых стресс-факторов) оказала сверхэкспрессия гена Hus1 у самцов и самок и генов Brca2 и WRNexo у самцов. Белки, кодируемые этими тремя генами, необходимы для инициации и координации различных механизмов репарации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК [10–12]. Белок HUS1 является составной частью комплекса 9-1-1, который играет центральную роль в сенсировании повреждений ДНК и инициации задержки клеточного цикла в S-фазе [13, 14]. Продукт гена Brca2 участвует в распознавании двунитевых повреждений ДНК и их репарации по типу гомологичной рекомбинации [15, 16]. Фермент WRNexo является RecQ-геликазой с эндонуклеазной активностью и участвует в репарации двунитевых разрывов ДНК по типу негомологичного воссоединения концов [17, 18].

Влияние сверхэкспрессии генов репарации ДНК на устойчивость особей Drosophila melanogaster к действию окислительного стресса, гипертермии и голоданию

Вариант эксперимента	Паракват 20 мМ			Гипертермия 35 °С			Голодание
Вариант эксперимента	М	X ± Δ m	48 ч	М	X ± Δ m	24 ч	М	X ± Δ m	48 ч
♂ UAS-Brca2/GS-GAL4 (-)	54	53.3±1.7*	46	33	36.6±0.9	6	32	36.4±1.0	98
♂ UAS-Brca2/GS-GAL4 + RU486 (+)	46	49.6±3.0	59*	48*	39.6±1.0*	12	48*	44.1±1.5*	81*
♀ UAS-Brca2/GS-GAL4 (-)	31	40.9±2.0	73	48	41.8±0.8	5	48	42.3±1.1	80
♀ UAS-Brca2/GS-GAL4 + RU486 (+)	22*	35.1±2.1*	82	33*	34.5±0.6*	14*	33*	38.8±1.0	96
♂ UAS-Hus1/GS-GAL4 (-)	55	62.4±2.3	28	23	29.8±1.0	9	48	40.6±0.8	86
♂ UAS-Hus1/GS-GAL4 + RU486 (+)	55*	51.6±3.1*	50*	32*	34.6±1.1*	31*	48*	48.9±1.2*	78
♀ UAS-Hus1/GS-GAL4 (-)	46	45.9±2.0	66	32	29.5±0.8	45	48	52.1±1.2	59
♀ UAS-Hus1/GS-GAL4 + RU486 (+)	55*	62.3±2.8*	46*	32*	37.0±0.9*	9*	48	44.6±1.3*	71*
♂ UAS-Ku80/GS-GAL4 (-)	78	80.0±1.5	9	39	32.8±0.8	38	32	38.9±1.0	30
♂ UAS-Ku80/GS-GAL4 + RU486 (+)	70	76.7±2.6	18*	24*	26.3±0.8*	76*	32	34.9±1.1*	99*
♀ UAS-Ku80/GS-GAL4 (-)	46	58.3±2.4	56	39	38.9±0.3	2	48	42.1±1.2	100
♀ UAS-Ku80/GS-GAL4 + RU486 (+)	31	56.1±3.5	58	39	35.8±0.7*	17*	32*	36.6±0.9*	76
♂ UAS-mei-9/GS-GAL4 (-)	78	84.9±3.5	25	39	32.2±0.9	40	48	42.2±2.1	66
♂ UAS-mei-9/GS-GAL4 + RU486 (+)	46*	59.1±2.6*	52*	24*	28.0±0.8*	69*	48	40.3±1.0*	87*
♀ UAS-mei-9/GS-GAL4 (-)	70	69.9±3.5	41	39	36.7±0.7	14	48	53.4±1.8	68
♀ UAS-mei-9/GS-GAL4 + RU486 (+)	70	73.7±4.4	43	39	39.6±0.7*	9	48	48.6±1.6*	65
♂ UAS-mnk/GS-GAL4 (-)	54	54.3±2.2	26	31	33.8±0.9	23	33	37.9±0.8	93
♂ UAS-mnk/GS-GAL4 + RU486 (+)	31*	38.3±1.6*	66*	31	32.5±0.8	20	48	40.9±1.4*	73*
♀ UAS-mnk/GS-GAL4 (-)	55	51.4±1.8	46	31	36.1±0.6	4	48	43.2±1.1	84
♀ UAS-mnk/GS-GAL4 + RU486 (+)	48	50.9±2.1	60*	48*	40.1±0.8*	5	48*	39.3±1.1	94
♂ UAS-mus210/GS-GAL4 (-)	55	60.4±2.3	32	32	27.4±0.5	49	48	43.1±1.1	88
♂ UAS-mus210/GS-GAL4 + RU486 (+)	70*	69.5±2.4	30	23*	23.7±0.4*	85*	48	38.1±1.1	99*
♀ UAS-mus210/GS-GAL4 (-)	46	49.1±2.3	67	39	39.4±0.3	2	48	41.4±1.0	93
♀ UAS-mus210/GS-GAL4 + RU486 (+)	30*	42.6±2.1	81*	39	32.6±0.8*	34*	48	44.7±1.3*	69*
♂ UAS-Rrp1/GS-GAL4 (-)	72	63.2±1.9	31	24	27.5±0.8	67	56	60.1±1.4	29
♂ UAS-Rrp1/GS-GAL4 + RU486 (+)	72	62.3±2.2	33	39*	34.4±0.7*	26*	47*	50.7±1.3*	62*
♀ UAS-Rrp1/GS-GAL4 (-)	72	68.0±2.7	38	39	38.6±0.5	7	47	55.0±1.1	55
♀ UAS-Rrp1/GS-GAL4 + RU486 (+)	47*	48.2±2.0*	73*	24*	29.3±0.9*	57*	47	49.8±1.6*	51
♂ UAS-WRNexo/GS-GAL4 (-)	80	81.6±3.0	26	32	29.4±0.6	42	31	32.2±1.1	98
♂ UAS-WRNexo/GS-GAL4 + RU486 (+)	80	64.9±3.3*	37	32	30.4±0.5	26*	48*	46.8±1.0*	75*
♀ UAS-WRNexo/GS-GAL4 (-)	95	91.1±4.0	28	32	29.8±0.5	37	48	44.4±0.8	93
♀ UAS-WRNexo/GS-GAL4 + RU486 (+)	72*	77.9±3.5*	36*	32	33.6±0.8	21*	48	43.0±0.9	91

Обозначения: ♂ – самцы; ♀ – самки; (-) – без сверхэкспрессии; (+) – сверхэкспрессия; М – медианная продолжительность жизни (сут); X ± Δ m – средняя продолжительность жизни (сут); 48 ч и 24 ч – процент умерших особей через 48 ч и 24 ч после начала воздействия; * – p<0.05 ( M – критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона; X ± Δ m – критерий Колмогорова-Смирнова, 48 ч и 24 ч – φ-критерий Фишера). Объем выборок 110–120 мух на вариант эксперимента.

Мутация в гене данного белка у человека приводит к развитию тяжелого заболевания с симптомами преждевременного старения – синдрома Вернера [19]. Полученные результаты демонстрируют важную роль этих генов в обеспечении стрессоустой-чивости целого организма.

Однако в большинстве случаев наличие в геноме дрозофил дополнительных активных копий генов репарации ДНК не стимулировало стрессо-устойчивость особей, а, напротив, ухудшало ее. Отсутствие или слабая выраженность стимулирования стрессоустойчивости может быть связана с недостаточной эпигенетической регуляцией процесса репарации ДНК. Например, показано, что в фибробластах человека повышенная активность генов репарации ДНК замедляет клеточное старение только на фоне одновременной сверхэкспрессии гена деацетилазы гистонов SIRT6 [20]. Другой причиной снижения продолжительности жизни могут быть нарушение баланса между различными внутриклеточными путями и энергетическое истощение. Поскольку репарации ДНК – это процесс, требующий больших энергетических затрат [21], следовательно, сверхактивация изучаемых генов могла привести к чрезмерному расходу энергии в ущерб другим жизненно важным процессам.

Работа поддержана грантом РФФИ № 1404-01596, грантом Президента РФ МД-1090.2014.4 «Сравнение механизмов ответа Drosophila mela-nogaster на оксидативный, тепловой, холодовой и генотоксический стрессы с использованием полногеномного анализа транскриптомов», грантом Президиума РАН № 12-П-4-1005 «Экологическая генетика продолжительности жизни модельных животных ( Drosophila melanogaster, Mus musculus )» и молодежного гранта УрО РАН № 14-4-НП-103 «Изучение влияния активации генов стресс-ответа и циркадных ритмов на старение и стрессоустойчивость Drosophila melanogaster».

Список литературы Влияние кондиционной повсеместной сверхэкспрессии генов репарации ДНК на устойчивость особей Drosophila melanogaster к действию стресс-факторов различной природы (оксидативному стрессу, тепловому шоку, голоданию)

Moskalev A.A., Plyusnina E.N., Shaposhnikov M.V. Radiation hormesis and radioadaptive response in Drosophila melanogaster flies with different genetic backgrounds: the role of cellular stress-resistance mechanisms//Biogerontology. 2011. Vol. 12. № 3. P. 253-263
Symphorien S., Woodruff R. C. Effect of DNA repair on aging of transgenic Drosophila melanogaster: I. mei-41 locus//J. of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 2003. Vol. 58. № 9. P. 782-787
Walter C. A., Zhou Z. Q., Manguino D., et al. Health span and life span in transgenic mice with modulated DNA repair//Annals of the New York Academy of Sciences. 2001. Vol. 928. P. 132-140
Mizoguchi M., Naito H., Kurata Y. et al. Influence of aging on multi-organ carcinogenesis in rats induced by N-methyl-N-nitrosourea//Jpn. J. Cancer Res. 1993. Vol. 84. № 2. P. 139-146
Moskalev A., Plyusnina E., Shaposhnikov M. et al. The role of D-GADD45 in oxidative, thermal and genotoxic stress resistance//Cell Cycle. 2012. Vol. 11. № 22. P. 4222-4241
Osterwalder T. A., Yoon K. S., White B. H., Keshishian H. Conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. №22. P. 12596-12601
Roman G., Endo K., Zong L., Davis R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. №22. P. 12602-12607
Souza-Pinto N. C., Croteau D. L., Hudson E. K. et al. Age-associated increase in 8-oxo-deoxyguanosine glycosylase/AP lyase activity in rat mitochondria//Nucleic acids research. 1999. Vol. 27. № 8. P. 1935-1942
Heininger K. Ageing is a deprivation syndrome driven by a germ-soma conflict//Ageing research reviews. 2002. Vol. 1. № 3. P. 481-536
Xu M., Bai L., Gong Y., Xie W. et al. Structure and functional implications of the human rad9-hus1-rad1 cell cycle checkpoint complex//J. Biol. Chem., 2009. Vol. 284. № 31. P. 20457-20461
Roy R., Chun J., Powell S.N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection//Nat. Rev. Cancer., 2011. Vol. 12. № 1. P. 68-78
Kuper J., Kisker C. DNA Helicases in NER, BER, and MMR//Adv. Exp. Med. Biol., 2013. Vol. 767. P. 203-224
Abdu U., Klovstad M., Butin-Israeli V., et al. An essential role for Drosophila hus1 in somatic and meiotic DNA damage responses//J. Cell Sci. 2007. Vol. 120. № Pt 6. P. 1042-1049
Kadir R., Bakhrat A., Tokarsky R., et al. Localization of the Drosophila Rad9 protein to the nuclear membrane is regulated by the C-terminal region and is affected in the meiotic checkpoint//PLoS One. 2012. Vol. 7. № 5. P. E38010
Brough R., Wei D., Leulier S., et al. Functional analysis of Drosophila melanogaster BRCA2 in DNA repair//DNA Repair (Amst). 2008. Vol. 7. № 1. P. 10-19
Klovstad M., Abdu U., Schьpbach T. Drosophila brca2 is required for mitotic and meiotic DNA repair and efficient activation of the meiotic recombination checkpoint//PLoS Genet. 2008. Vol. 4. № 2. P. E31
Boubriak I., Mason P. A., Clancy D. J., et al. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease//Biogerontology. 2009. Vol. 10. № 3. P. 267-277
Saunders R. D., Boubriak I., Clancy D. J., et al. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity//Aging Cell. 2008. Vol. 7. № 3. P. 418-425
Opresko P. L., Cheng W. H., von Kobbe C., et al. Werner syndrome and the function of the Werner protein; what they can teach us about the molecular aging process//Carcinogenesis. 2003. Vol. 24. № 5. P. 791-802
Mao Z., Tian X., Van Meter M., et al. Sirtuin 6 (SIRT6) rescues the decline of homologous recombination repair during replicative sense cence//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109. № 29. P. 11800-11805
Halmosi R., Berente Z., Osz E., et al. Effect of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors on the ischemia-reperfusion-induced oxidative cell damage and mitochondrial metabolism in Langendorff heart perfusion system//Mol. Pharmacol. 2001. Vol. 59. № 6. P. 1497-1505

Еще

Статья научная