Влияние криоконсервации на биологические параметры семени у гибридов романовской породы и архара

Искусственное осеменение — один из основных элементов воспроизводства сельскохозяйственных животных. Эффективное ведение животноводства на современном этапе невозможно без применения этого метода (1-5). Важнейшим звеном вспомогательной репродуктивной технологии считается криоконсервация биологического материала: генеративной плазмы, эмбрионов, половых и соматических клеток (6-8).

Наиболее распространенным генетическим материалом, используемым в программах по сохранению и восстановлению генетических ресурсов дикой фауны и домашних животных, служат сперматозоиды (9). Это связано с доступностью и легкостью получения спермы (5-6 млрд половых клеток на один эякулят). Кроме того, для многих видов животных разра-

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ ¹ 16-14-00039. При проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста.

ботана технология искусственного осеменения с использованием заморо-жено-оттаянного семени.

Криоконсервация спермы позволяет накапливать запас жизнеспособного генеративного материала от высокоценных производителей, более эффективно его использовать, получать максимальное количество потомства, сохранять и восстанавливать численность редких и исчезающих видов, а также проводить скрещивание и гибридизацию между изолированными популяциями. Криоконсервация сперматозоидов состоит из нескольких взаимосвязанных технологических обработок семени, которые приводят к изменениям отдельных структурных единиц сперматозоидов, что часто сопровождается снижением их биологической полноценности (10-14). Показано влияние цикла замораживания-оттаивания на морфологию сперматозоидов (15-19). У всех сельскохозяйственных животных при использовании криоконсервированного семени выход потомства снижается. По мнению ряда исследователей, это связано с уменьшением подвижности сперматозоидов, поскольку для достижения яйцеклетки они должны иметь высокую скорость прямолинейного поступательного движения (20). Низкую вероятность оплодотворения яйцеклетки также имеют сперматозоиды с высокой активностью, но наличием ультраструктурных, биохимических, функциональных повреждений (21, 22).

Применение вспомогательной репродуктивной технологии в овцеводстве носит локальный характер, что связано с невысокой эффективностью криоконсервации семени баранов. Его значительно труднее замораживать, чем сперму других видов млекопитающих. Около 10 % эякулята, полученного от баранов с использованием современных разбавителей и протоколов, криоконсервации не подвергаются (23), в связи с чем требуется оптимизировать технологию криоконсервации сперматозоидов у этого вида животных.

В качестве одного из перспективных способов генетического совершенствования пород овец рассматривается прилитие крови диких видов. Во Всероссийском НИИ животноводства им. Л.К. Эрнста создана модельная популяция, включающая гибридов домашних романовских овец ( Ovis aries ) и архара ( O. ammon ) с разной долей кровности дикого вида. Было показано изменение биологических и продуктивных показателей у особей, несущих кровь диких животных, по сравнению с исходным домашним видом (24, 25). Создан банк семени гибридных животных (26).

В настоящем исследовании мы впервые изучили показатели биологической полноценности семени гибридных баранов с разной долей кров-ности по романовской породе и архару в сравнении с их чистопородными аналогами. Показано влияние криоконсервации на криорезистентность, осмотическую резистентность и дегидрогеназную активность семени. Отмечено повышение этих показателей у гибридных животных, свидетельствующее о более высокой криоустойчивости их семени по сравнению с семенем чистопородных баранов.

Цель представленной работы заключалась в изучении влияния цикла замораживания и оттаивания на биологические параметры сперматозоидов гибридных (с кровью архара) и чистопородных романовских баранов-производителей.

Методика. Материалом для исследований служила сперма гибридных баранов с разной долей кровности по романовской породе и архару: гибрид F1 (n = 1, 50 % крови архара, получен посредством хирургического осеменения романовской овцы заморожено-оттаянным семенем архара), возвратный кросс BC1 (n = 5, 25 % крови архара, получен при скрещива- нии романовских овец с бараном F1), возвратный кросс BC2 (n = 5, 12,5 % крови архара, получен посредством скрещивания романовских овец с баранами BC1). Сперму романовских баранов (ROM) (n = 3) использовали в качестве контроля. Все бараны находились в одинаковых условиях кормления и содержания. Были изучены показатели качества свежеполученно-го разбавленного и замороженно-оттаянного семени.

Сбор семени проводили в искусственную вагину. Разбавление, глубокое замораживание и оттаивание осуществляли в соответствии с собственной методикой криоконсервации семени баранов в гранулах.

Для распознавания и оценки каждого сперматозоида по заданным параметрам использовали программное обеспечение Зоосперм 1.0 (ООО «ВидеоТесТ», г. Санкт-Петербург, Россия). Принцип работы этой программы основан на обработке видеоизображений (27). Целостность акро-сом изучали при дифференциальном окрашивании с применением набора Диахим-Дифф-Квик («АБРИС+», Россия). Индекс фрагментации ДНК в хроматине определяли, выявляя наличие разрывов в ДНК с помощью теста с акридиновым оранжевым (АО-тест) и флуоресцентной микроскопии («Nikon», Япония).

Данные обрабатывали статистически с помощью пакета программ Microsoft Office. В таблицах представлены средние (Х ) и их отклонения ( х ).

Результаты. Анализ подвижности сперматозоидов в свежеполучен-ном и замороженном семени гибридных животных и их чистопородных аналогов не выявил значительных различий по этому показателю. Доля сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением (класс А + В) в обеих экспериментальных группах была практически одинаковой: у гибридных животных — 90,0 % для свежеполученного семени и 43,0 % после криоконсервации, у чистопородных — соответственно 93,0 и 43,0 %. Доля сперматозоидов класса С (с манежным движением) и класса Д (неподвижные) в свежеполученном семени у гибридов не превышала 4,3 и 5,7 %, у чистопородных животных — 3,6 и 3,4 %. В процессе замораживания-оттаивания количество неподвижных сперматозоидов у гибридных баранов увеличивалось до 48,6 %, у их чистопородных аналогов — до 51,2 %.

Показатели осмотической и гипоосмолярной резистентности, а также дегидрогеназной активности сперматозоидов у гибридных и чистопородных животных находились в пределах установленных требований (табл. 1). Вместе с тем они были выше у гибридов. Различия между ROM и F1 составили по показателю криорезистентности 9,0 %, осмотической резистентности — 20,0 %, дегидрогеназной активности — 44,5 %. С увеличением числа генераций различия нивелировались: в третьем поколении гибриды превосходили своих чистопородных аналогов по криорезистентности на 2,2 %, по осмотической резистентности — на 4,7 %, по дегидро-геназной активности — на 10,0 %.

1. Показатели криоустойчивости сперматозоидов, полученных от гибридных и чистопородных романовских баранов ( Х ± х )

Группа	Криорезистентность	Осмотическая резистентность	Дегидрогеназная активность, мин
ROM	0,44±0,02	0,21±0,06	7,82±0,65
F 1	0,48±0,03	0,25±0,08	11,31±0,38
BC 1	0,45±0,02	0,23±0,06	9,09±0,47
BC 2	0,43±0,03	0,22±0,01	8,61±0,22

П р и м еч а ни е. Описание групп см. в разделе «Методика».

Изучение влияния криоконсервации на морфометрические показатели сперматозоидов выявило некоторые различия между экспериментальными группами. Доля сперматозоидов с нарушенной морфологией в свежем эякуляте, полученном от гибридных ба- ранов, составляла 10,7 %, что было на 3,1 % выше аналогичного показателя для чистопородных животных. Наблюдалась разница между группами по частоте встречаемости аномальной морфологии отдельных сегментов сперматозоидов. Более высокий процент нарушений в строении сперматозоидов у чистопородных производителей отмечали в области жгутика, у гибридных баранов — в средней части (рис.).

Частота нарушений морфологии в отдельных сегментах сперматозоидов у баранов-производителей романовской породы (А) и гибридов с архаром ( Ovis ammon ) (в среднем по трем группам) (Б) в замороженно-оттаянном семени: 1 — аномалии жгутика, 2 — аномалии головки, 3 — аномалии средней части.

При замораживании и оттаивании число сперматозоидов с нарушенной морфологией повышалось как у гибридных, так и у чистопородных животных. При этом процентное соотноше- ние частоты встречаемости аномального строения в отдельных сегментах сперматозоидов внутри экспериментальных групп практически не изменялось.

Оценка состояния акросом и степени фрагментации хроматина сперматозоидов в свежеполученном и замороженном семени выявила снижение показателей у гибридных животных по сравнению с чистопородными аналогами. Разница между романовскими баранами и экспериментальными группами ВС1 и ВС2 по количеству сперматозоидов с интактными акросомами для свежеполученного семени составила 2,5-3,2 %,

2. Оценка сперматозоидов у гибридных и чистопородных романовских баранов по состоянию акросом и степени фрагментации хроматина до и после криоконсервации ( Х ± х )

Группа	Доля сперматозоидов с интактными акросомами, %	Степень фрагментации хроматина, %
	СПС      ЗОС	СПС   ЗОС

ROM	92,4±5,2	90,3±8,7	11,6±3,9	12,7±1,7
F 1	96,5±6,7	88,3±4,7	8,6±2,8	12,7±3,5
BC 1	89,9±8,3	86,4±5,7	6,5±2,7	9,5±2,4
BC 2	89,2±1,6	85,1±4,6	8,2±3,8	12,3±3,2

П р и м еч а ни е. СПС — свежеполученное семя, ЗОС — за- мороженно-оттаянное семя. Описание групп см. в разделе «Методика».

для замороженно-оттаянно-го — 3,9-5,2 %, по степени фрагментации хроматина — соответственно 25,8-43,9 и 021,2 % (табл. 2). При этом мы не выявили корреляции между изменением представленных показателей и долей кровности архара.

В процессе замораживания-оттаивания во всех группах отмечалось снижение доли сперматозоидов с интактными акросомами при повышении индекса фрагментация ДНК. У гибридных животных различия были более выраженными и составили соответственно 4,6-8,4 % и 45,1-47,6 %, у чистопородных — 2,2 и 9,5 %.

Таким образом, после криоконсервации семени, полученного как от гибридных, так и от чистопородных животных отмечалось снижение биологической полноценности сперматозоидов. Семя гибридов было более криоустойчивым по сравнению со спермой романовских баранов: у гибридных животных в процессе криоконсервации подвижность сперматозоидов снизилась на 47,0 %, у чистопородных — на 50,0 %. Показатели криорезистентности сперматозоидов у гибридов также были повышены по сравнению с исходной домашней формой. Со снижением доли кровности архара и приближением по кровности к домашней форме различия по таким биологическим параметрам, как криорезистентность, осмотическая резистентность и дегидрогеназная активность, нивелировались: разница между производителями материнской породы и гибридами BC2 составляла соответственно 2,2, 4,7 и 10,0 %. В эякуляте гибрида F1 содержание сперматозоидов с интактными акросомами было выше на 4,1 %. В свежеполу- ченном эякуляте гибридов степень фрагментации ДНК в хроматине оказалась ниже, чем у исходной романовской породы.