Влияние легкого стресса на метаболические эффекты беговых нагрузок у мышей с моделью сахарного диабета II типа

Сахарный диабет II типа считают одной из важнейших проблем современности, на него приходится около 90% случаев диабета. Его патогенез связан с резистентностью к инсулину в периферических тканях и, вследствие этого, возрастание концентрации глюкозы в крови (Fujim ki & Kuw b r , 2017;

Физические нагрузки разной интенсивности приводят к запуску большого количества биохимических, молекулярных, генетических и эпигенетических механизмов, лежащих в основе адаптационных реакций организма на физиологический стресс (Coffey & H wley, 2007). Физическая нагрузка оказывает как непосредственное влияние на скелетную мускулатуру, так и системное воздействие на организм. Большое количество исследований подтверждает, что занятия оздоровительной физкультурой являются профилактической мерой множества заболеваний и поддержания функционирования систем организма на должном уровне. В частности, показано, что физические нагрузки оказывают положительное воздействие при метаболических нарушениях (K rstoft & Pedersen, 2016;

Существуют исследования, по данным которых послеобеденная тренировка была более эффективной, чем утренняя, в снижении уровня глюкозы в крови у мужчин с диабетом 2 типа (S vik

В связи со всем изложенным целью нашего исследование было изучить влияние светового стресса на метаболические эффекты беговых нагрузок у мышей с моделью сахарного диабета II типа.

MATERIALS AND METHODS

В качестве объекта исследования использовали мышей-самцов линии C57bl/6 в возрасте 4 недели. Мыши были получены из вивария Томского национального исследовательского медицинского центра РАН, НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Гольдберг. Режим содержания животных: день/ночь: 12/12 часов, начало светового дня в 6 часов утра, свободный доступ к пище и воде, температура в помещении 24°С.

Исследование проведено в соответствии с принципами Базельской декларации и одобрено Комиссией по биоэтике Биологического института Томского государственного университета (протокол № 32 от 2 декабря 2019 г.).

В эксперименте использовалось 30 мышей. До 12-й недели эксперимента все мыши получали вышеописанную диету.

Начиная с 12-й недели животные были разделены на три подгруппы.

• •    Контрольная группа (10 мышей). Животный продолжали получать питание по той же схеме, не подвергаясь принудительным физическим нагрузкам.

• •    2-я экспериментальная (группа «свет») – животные подвергались принудительным физическим нагрузкам в темное время суток (с 19-00 до 21-00 часа, период активности) в условиях освещенной комнаты.

• •    3-я экспериментальная (группа «темнота») – животные подвергались

принудительным физическим нагрузкам в темное время суток (с 19-00 до 21-00 часа, период активности) в условиях темной комнаты (слабая подсветка рассеянным красным светом).

Массу тела измеряли с помощью лабораторных весов. Измерения проводились по завершении 1, 4, 8, 12 и 16 неделе эксперимента.

Измерение концентрации глюкозы в крови осуществляли в конце 1, 12 и 16 недели с помощью портативного глюкометра ПКГ-02.4 Сателлит Плюс (ООО «Компания «ЭЛТА», Россия). Образцы крови получали путем пункции хвостовой вены. Для проверки толерантности к глюкозе мышам не давали пищу в течение 4 часов, сохраняя свободный доступ к воде, утром животных взвешивали и определяли концентрацию глюкозы в крови (0 мин). Затем животным внутрибрюшинно вводили 40% раствор глюкозы (2 г/кг массы тела) (углеводная нагрузка). Концентрацию глюкозы в крови определяли через 15, 30, 60 и 120 минут после углеводной нагрузки. Оценивали максимальную достигнутую концентрацию, время достижения пика и время возврата к исходному уровню.

Концентрация инсулина в плазме определялась в день завершения эксперимента. Кровь забирали дважды – до введения глюкозы и через 15 минут после нее. Кровь собирали в капиллярные пробирки Microvette S rstedt (Германия) 200 мкл с К3ЭДТА. Концентрацию инсулина в плазме крови мышей определяли методом иммуноферментного анализа с использованием набора ИФА для инсулина мыши (Cryst lChem, США).

Концентрацию кортизола определяли в сыворотке крови животных иммуноферментным методом на с использованием стандартных тест-наборов (ЗАО “НВО Иммунотех”, Россия). Для этого кровь забиралась через 24 часа после последней физической нагрузки.

Забой подопытных животных проводили декапитацией через 24 часа после последней загрузки. M.g strocnemius вырезали из обеих задних конечностей, мышечную ткань очищали от соединительной и жировой ткани и замораживали в жидком азоте. Собранные образцы хранили в морозильной камере при температуре -80°С. Определение содержания Glut 4 в мышечной ткани проводили методом вестерн-блоттинга. Гомогенизацию мышечной ткани для вестерн-блоттинга проводили в соответствии с протоколом и инструкциями. Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в денатурирующих условиях и по методике, описанной L emmli с 5% концентрирующим и 7% разделяющим гелями с использованием электрофоретической системы (электрофоретическая ячейка (Mini-PROTEAN Tetr Bio-R d, США). Данные вестерн-блоттинга представлены в относительных единицах по сравнению с показателями здоровых животных, не подвергавшихся принудительным физическим нагрузкам (в %).

Данные представлены как среднее ± ошибка среднего. После проверки нормального распределения данных с помощью критерия Колмогорова-Смирнова характеристики были проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса или Фридмана. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ Gr phP d Prism.

RESULTS

Результаты определения массы тела у экспериментальных животных представлены в таблице 1. В начале эксперимента различий между группами не было. Начиная с 12-й недели животные экспериментальных групп подвергались воздействию принудительных физических нагрузок. К 16-й неделе в обоих экспериментальных группах масса тела достоверно снизилась, однако в группе, тренирующейся на свету, снижение было более выраженным.

Результаты теста на толерантность к глюкозе (GTT) представлены в таблице 2. На первой неделе у всех животных регистрируется нормальная сахарная кривая – максимум концентрации глюкозы в крови достигается между 30 и 60 минутами а через два часа показатель возвращается к исходным значениям. На 12-й неделе эксперимента мы наблюдаем у всех групп животных изменение GTT, характерные для диабета – уровень глюкозы в крови существенно возрастает уже на 15-й минуте и сохраняется в течении часа, через два часа наблюдается некоторое снижение, но исходных значений оно не достигает.

Гипогликемическая фаза косвенно отражает скорость выработки инсулина и чувствительность тканей к данному гормону. Пролонгация этой фазы характерна для сахарного диабета 2-го типа, что и наблюдалось у мышей экспериментальной группы в данном исследовании.

На 16 неделе эксперименте мы наблюдали существенные различия в результатах GTT между всеми тремя группами животных. В контрольной группе концентрация глюкозы в крови оставалась высокой до 60 минуты, затем несколько снижалась. В то ж время в группах мышей, подвергавшихся принудительным физическим нагрузкам, концентрация глюкозы была ниже на 15 минуте и существенно снижалась к 120-й минуте. В группе животных, выполняющих физически нагрузки в освещённой комнате, снижение отмечалось уже на 60-й минуте. Описанные изменения можно трактовать как свидетельствующие о частичной нормализации углеводного обмена и восстановлении способности мышиных клеток утилизировать глюкозу. Причем эффект принудительных физических нагрузок, выполняемых на свету, был более выражен в сравнении с темнотой.

В таблице 3 представлены некоторые биохимические показатели у мышей на 16 неделе эксперимента – концентрация инсулина и кортизола в плазме, а так же содержание транспортера глюкозы GLUT-4 в мышечной ткани экспериментальных животных.

Базальная концентрация инсулина в плазме всех групп животных не различалась и была в диапазоне 0,8-1,1 нг/мл. На фоне ведения глюкозы она возрастала, причем в группе мышей, подвергавшихся принудительным физическим нагрузкам в темноте, прирост был достоверно ниже.

Таблица 1 Величины массы тела мышей с моделью сахарного диабета типа II Х ±SE

Группы	Недели эксперимента
	1	4	8	12	16
Контроль	19,7±1,2	27,0±1,2	35,5±1,7	42,5±2,0	45,2±2,2
Эксперимент на свету	19,5±1,1	28,1±1,3	35,8±1,7	43,1±2,1	33,2±1,8*
Эксперимент в темноте	20,5±1,2	27,5±1,4	36,1±1,5	42,8±2,2	37,3±1,5*#

* - достоверность различий с контрольной группой (p<0.05)

# - достоверность различий между группами, подвергавшихся нагрузкам на свету и в темноте (p<0.05)

Таблица 2 Показатели теста на толерантность к глюкозе у мышей с моделью сахарного диабета типа II (Х ±SE )

Недели эксперимента	1			12			16
Минуты после введения глюкозы	15`	60`	120`	15`	60`	120`	15`	60`	120`
Контроль	6,4±1,5	14,2±1,3	7,3±0,9	20,3±2,0	21,9±1,8	17,3±2,1	23,5±1,3	24,7±1,1	18,8±0,9
Эксперимент на свету	6,3±1,3	14,5±1,4	7,5±0,8	21,5±1.7	22,2±2.3	17,8±1.8	15,0±1,1	11,4±0,9*	8,3±0,8*
Эксперимент в темноте	6,4±1,3	13,28±1,0	7,9±1.1	22,3±2,1	22,5±2.1	18,1±2,2	15,1±1,1	14,4±1,0*#	10,8±0,9*#

* - достоверность различий с контрольной группой (p<0.05)

# - достоверность различий между группами, подвергавшихся нагрузкам на свету и в темноте (p<0.05)

Таблица 3 Биохимические показатели у мышей с моделью сахарного диабета типа II после принудительной физической активности (16-я неделя эксперимента) (Х ±SE )

Группы	Инсулин в плазме, нг/мл	Кортизол в плазме, нмоль/л	GLUT-4 в мышечной ткани, % от показателя у здоровых животных
Контроль	2,5±0,1	153,2±12,4	59,2±3,5
Эксперимент на свету	2,4±0,1	238,5±11,9*	68,3±4,1*
Эксперимент в темноте	2,0±0,1*#	201,7±10,7*#	84,5±5,2*#

* - достоверность различий с контрольной группой (p<0.05)

# - достоверность различий между группами, подвергавшихся нагрузкам на свету и в темноте (p<0.05)

DISCUSSION

Принудительные физические нагрузки в виде ежедневного бега на тредмиле оказывают целый ряд выраженных эффектов на метаболизм у мышей с моделью сахарного диабета II типа. Прежде всего это проявляется в снижении массы тела. Так же физические нагрузки сопровождаются возрастанием скорости усвоения глюкозы и повышением концентрации инсулина. Все изложенное свидетельствует о нормализации углеводного обмена под влиянием регулярных физических нагрузок и инволюции изменений, характерных для диабета II типа. Причем механизм этих изменений связан с одним из основных патогенетических факторов диабета – жировая диета у мышей сопровождается снижением содержания GLUT-4 в мышечной ткани, а принудительные физические нагрузки – напротив, его увеличением. Увеличение содержания GLUT-4 на фоне физических нагрузок подтверждено в ряде исследований.

Включение освещение в темновую фазу активности животных, ведущих ночной образ жизни, так же является мощным стрессогенным фактором. Полученные результаты свидетельствуют, что освещение усиливало метаболические эффекты принудительной физической активности. Известно, что регуляция активности животного светом может обходить механизмы внутренних часов. Описан так называемый эффект маскинга, частным проявлением которого является снижение активности в связи с внезапным освещением в скотофазу (Mrosovsky, 1999), однако при использовании света низкой интенсивности (соразмерной лунному свету) активность, напротив, повышается (Kempinger et l., 2008; Schlichting et l., 2014). Маскинг способен вызвать состояние покоя или активности, однако не влияет на внутренний суточный ритм (Viv nco et l., 2010). Таким образом, дополнительный стрессовый фактор в виде освещения способен влиять на метаболические эффекты физической активности.

Таким образом, физическая активность, внедряемая с учетом циркадианных ритмов, является перспективным способом воздействия на метаболические процессы, что важно для поиска новых путей коррекции метаболических нарушений. Однако влияние факторов сочетания суточных ритмов и освещённости необходимо учитывать как при построении экспериментов, та и при использовании физических нагрузок в реабилитации пациентов с сахарным диабетом II типа.

ACKNOWLEDGEMENTS

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 19-15-00118, р

CONFLICTS OF INTEREST

The uthors decl re th t they h ve no conflict of interest.