Влияние мексидола на предсердный и мозговой натрийуретические пептиды миоцитов правого предсердия крыс в постреперфузионном периоде

Введение. Семейство натрийуретических пептидов является важным звеном в сложной системе поддержания водно-солевого баланса в организме [1]. Среди сердечных гормонов наибольший интерес исследователей вызывают предсердный (ПНП) и мозговой (МНП) натрийуретический пептиды [2, 3]. Основные действия этих веществ - снижение артериального давления за счет натрийуретического, диуретического эффектов и ингибирование ренин–ангиотензин-альдо-стероновой системы [1, 4]. Несмотря на сходство ПНП и МНП в литературе имеются противоречивые данные об их физиологической эффективности и прогностической значимости [1, 5]. Для объективности выводов необходимо анализировать параллельно оба пептида [6]. Синтетические аналоги гормонов используют в клинике [1, 7]. В связи, с чем актуальной является проблема взаимодействия ПНП и МНП с препаратами, применяемыми в кардиологии, одним из которых является антигипоксант метаболического типа действия 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат – мексидол. Ранее нами были проведены исследования влияния мексидола на МНП в постреперфузионном периоде (ПРП) и частично на ПНП [8, 9, 10]. Для прояснения и детального анализа спорных моментов было проведено комплексное морфологическое исследование влияния препарата на продукцию натрийуретических пептидов на ранних и отдаленных сроках ПРП в эксперименте.

Цель исследования – в сравнительном аспекте изучить влияние мексидола на аккумуляцию и выделение предсердного и мозгового натрийуретических пептидов (ПНП и МНП) предсердных миоцитов крыс в постреперфузионном периоде (ПРП).

Материал и методы исследования. Эксперименты выполнены на 25 белых аутбредных Wistar крысах - самцах, массой 220-250г в соответствии с правилами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986г. и подтвержденной в 15.06.2006г.). Применяли модель клинической смерти по В.Г. Корпачеву [11]. Анализировались следующие группы животных: 1) интактные (n=5);

• 2)    контрольные животные через 60 мин ПРП (n=5);

• 3)    крысы через 60 мин ПРП с введением мексидола (n=5);

• 4)    контрольные животные через 60 сут ПРП (n=5);

• 5)    крысы через 60 сут ПРП с введением мек-сидола (n=5).

В 3-й и 5-й группах мексидол вводили после восстановления кровотока внутрибрюшинно в течение первого часа в три приема, в дозе 25 мг/кг. Электронно-микроскопический анализ образцов правого предсердия всех групп животных выполнялся по стандартной методике [12]. Локализацию ПНП и МНП выявляли на уль-тратонких срезах с помощью поликлональных антител: Rabbit anti-Atrial Natriuretic Factor (1-28) (rat), Rabbit anti-Brain Natriuretic Peptide-32 (Rat) Serum, Peninsula Laboratories. Inc., Bachem, США и вторых антител Protein-A/Gold (15 nm), ф. EM Grade, Electron Microscopy Sciences, США [8, 10]. Для каждого пептида реакции осуществляли отдельно. Срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Morgagni 268D (ф. FEI, США). Проводили подсчет гранул с иммунореактивным материалом в полях зрения (38х38 мкм). Выделяли два типа гранул: осмиофильные с четкой мембраной, осуществляющие хранение пептидов (А-тип) и менее электронноплотные с размытой мембраной, выделяющие пептиды (В-тип) [13]. Для исследования на светооптическом уровне образцы левого желудочка брали у интактных крыс, через 60 суток

ПРП и через 60 суток ПРП с введением мексидола (1-й, 4-й и 5-й групп). Образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин [14]. Приготовленные на микротоме SM 2000R (Leica, Австрия) срезы 5 – 7 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван Гизону; изучали с помощью светового микроскопа Eclips 80i (Nikon, Япония) и программы NIS-Elements BR 4.00.02. При увеличении х40 определяли площадь поперечного сечения кардиомиоцитов, процентное соотношение миоцитов, коллагеновых волокон и внеклеточного матрикса в полях зрения 2560х1920 мкм. Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 10.0 с помощью критерия Манна-Уитни (р<0,05).

Результаты исследования и их обсуждение. Через 60 мин ПРП полученные результаты выявили существенные различия воздействия мексидола на накопление и выведение натрийуретических пептидов. В опытной 3-й группе по количеству гранул было отмечено положительное влияние препарата на образование и выброс ПНП: сравнение с контрольной серией (2-й группой), в которой было зафиксировано повышенное количество пептида относительно интактной 1-й серии, показало повышение числа гранул А – типа на 38, В – типа на 42% и общего числа гранул на 37% (табл., рис. 1). В то же время мексидол незначительно снижал продукцию МНП: соотношение гранул

Таблица.

Количество гранул А – и В – типов, содержащих ПНП и МНП, предсердных миоцитов крыс в постреперфузионном периоде (M±m)

Группы животных	Гранулы, содержащие ПНП, тип		Гранулы, содержащие МНП, тип
	А	В	А	В
Интактные	65,75±2,76	38,90±2,88	16,00±0,77	7,53±0,38
60 мин ПРП	85,64±2,94	56,48±2,41	37,47±2,57	23,37±1,59
	P1=0,004301	P1=0,001499	P1=0,000190	P1=0,000002
	118,28±4,43	80,4±3,68	30,80±1,86	18,60±1,08
60 мин ПРП с мексидолом	P1=0,000002	P1=0,000001	P1=0,000001	P1=0,000000
	P2=0,000285	P2=0,000907	P2=0,320190	P2=0,124392
	105,17±3,99	54,70±3,78	50,60±2,55	26,96±1,41
60 сут ПРП	P1=0,000010	P1=0,007210	P1=0,000000	P1=0,000000
	P2=0,012420	P2=0,833668	P2=0,011709	P2=0,304423
	112,61±4,33	60,87±3,05	67,26±2,96	40,78±1,78
	P1=0,000030	P1=0,005210	P1=0,000000	P1=0,000000
60 сут ПРП с мексидолом	P2=0,002034	P2=0,833668	P2=0,000000	P2=0,000002
	P3=0,307015	P3=0,297047	P3=0,011100	P3=0,000001
	P4=0,635027	P4=0,025824	P4=0,000000	P4=0,000000

Примечание:

Р1 – достоверность различий относительно интактных животных;

Р2 - достоверность различий относительно 60 мин ПРП;

Р3 - достоверность различий относительно 60 сут ПРП;

Р4 - достоверность различий относительно 60 мин ПРП с мексидолом по тесту Манна-Уитни.

Рис. 1. Общее количество гранул с предсердным (ПНП) и мозговым (МНП) натрийуретическими пептидами у интактных и экспериментальных животных (по тесту Манна - Уитни).

Рис. 2. Площадь поперечного сечения кардиомиоцитов левого желудочка у интактных и экспериментальных животных через 60 суток постреперфузионного периода (по тесту Манна - Уитни).

Соотношение компонентов соединительной ткани и кардиомиоцитов в левом желудочке крыс через 60 сут ПРП

(' Коллагеновые волокна и Внеклеточный матрикс и Кардиомиоциты

Соотношение компонентов соединительной ткани и кардиомиоцитов в левом желудочке крыс через 60 сут ПРП с применением мексидола

. Коллагеновые волокна и Внеклеточный матрикс и Кардиомиоциты 2%  2%

Рис. 3. Соотношение тканевых компонентов в миокарде левого желудочка крыс: интактных (А), через 60 суток постреперфузионного периода (Б) и 60 суток постреперфузионного периода с введением мексидола (В).

было выше уровня интактной 1-й группы, однако общее количество гранул достоверно отличалось от контрольной 2-й группы, и было меньше на 18% (см. таблицу, рис. 1). Ранее обсуждалось цитопро-текторное свойство препарата, обусловленное антиоксидантной активностью 3-оксипиридинов и антигипоксическим свойством янтарной кислоты [15, 16]. Было показано сохранение ультраструктуры кардиомиоцитов [10]. Вазопротекторное свойство мексидола приводило к улучшению микроциркуляции, отсутствию агрегации эритроцитов [8]. По данным исследователей, препарат нивелировал скачок артериального давления, возникающий во время реанимационных мероприятий [17]. Есть мнение, ПНП вырабатывается больше в норме, МНП - при сердечно - сосудистой патологии [18]. Небольшое снижение продукции МНП на фоне увеличения ПНП могло быть хорошим признаком, отражающим положительное влияние мексидола на состояние миокарда. Увеличение накопления/выведения пептидов в контрольной 2-й группе животных было обусловлено действием факторов ишемии/реперфузии: HIF-1α (hypoxia inducible factor - 1α) и ET-1 (эндотелин 1) [1, 19, 20]. Предполагается, после стимуляции накопления и выброса ПНП и МНП введение мексидола дополнительно усиливало синтетические реакции в кардиомиоцитах. Смещение процессов в сторону увеличения продукции ПНП и уменьшения МНП происходило вследствие ограниченности клеточных резервов для образования дублирующих друг друга веществ.

Через 60 сут эксперимента также была выявлена разная реакция пептидов в ответ на введение мексидола в раннем ПРП. Было показано отсутствие эффекта препарата на продукцию ПНП: содержание гормона было увеличено относительно интактных животных, но не отличалось от контрольной 4-й группы, и, по сравнению с 3-й группой (60 мин ПРП с введением мескидола), происходило снижение выделения пептида из кардиомиоцитов: гранул В – типа и общее количество уменьшилось на 25 и на 12%, соответственно (табл., рис. 1). На МНП мексидол воздействовал, как сильный стимулятор, о чем свидетельствовало значительное увеличение количества гранул с пептидом по сравнению со всеми группами: по отношению к 4-й контрольной группе (60 сут ПРП) гранул А – типа было выше на 33, В – типа на 51% и их общего количества на 39% (табл., рис. 1).

Исследование миокарда левого желудочка на светооптическом уровне выявило гипертрофию кардиомиоцитов как в 4-й, так и в 5-й группе животных (через 60 сут ПРП с мексидолом и без препарата): достоверное увеличение площади поперечного сечения миоцитов на 23% относительно 1-й группы интактных животных (рис. 2). Повышенное содержание сердечных гормонов относительно показателей интактных животных могло быть связано с выявленной гипертрофией кардиомиоцитов у животных, как с применением препарата, так и без его введения: натрийуретические пептиды используются в качестве маркеров гипертрофии миокарда [1, 21]. В то же время в группе с введением мексидола было обнаружено уменьшение доли компонентов соединительной ткани в сердце практически до значений интактных животных (рис. 3а, б, в), что могло быть связано с антифиброзными свойствами ПНП и МНП: ингибированием пролиферации фибробластов и их синтетической активности [4, 22]. Более выраженная реакция МНП на введение мексидола объяснялась несколькими факторами. С одной стороны, препарат, введенный в раннем ПРП, оказывал пролонгированный эффект, который объяснялся медленным ответом пептида на различные воздействия [1, 23]. С другой стороны, некоторые исследователи считают МНП более продуктивным гормоном, чем ПНП в плане действия на органы-мишени: наличие гипертрофии являлось стимулирующим для усиления образования и выведения пептида, обладающего антигипертрофическим свойством [4, 24]. Однако, есть мнение, что большое количество гранул с МНП является не положительным, а отрицательным фактором, так как длительная экспозиция пептида может усугублять ремоделирование миокарда в эксперименте [25]. Наконец, увеличение содержания МНП на фоне снижения выделения ПНП могло свидетельствовать о переходе системы натрийуретических гормонов на новый уровень функционирования. По-видимому, существует некий баланс между пептидами: при достижении определенного уровня происходит смещение продукции в сторону увеличения одного из них и уменьшения другого.

Полученные данные свидетельствуют о значительных отличиях в механизмах запуска образования и выброса сердечных гормонов в ответ на действие фармакологических веществ.

Таким образом, была выявлена разная реакция пептидов в ответ на введение мексидола в дозе 25 мг/кг. В раннем ПРП препарат усиливал продукцию ПНП и незначительно снижал МНП, относительно контрольных животных. В отдаленном ПРП, напротив, практически не отражался на накоплении/выделении ПНП и значительно стимулировал МНП. Проведенное исследование вносит вклад в понимание взаимодействия натрийуретических пептидов с лекарственными средствами в условиях сердечно - сосудистой патологии.