Влияние начального рН послеспиртовой барды на рост и накопление белка грибом Lentinus tigrinus

• В.    В. Ревин, доктор биологических наук (Саранск)

В настоящее время практически в каждом регионе России действует биотехнологическое производство этилового спирта, причем в большинстве случаев предприятия в качестве основного субстрата используют зерносырье, что обеспечивает возможность получения экологически чистой и высококачественной продукции, отвечающей стандартам качества, в частности, серии ISO 9000 и требованиям ВТО — спирты марки «Базис», «Люкс», «Альфа». Однако биотехнологические производства этилового спирта во многих случаях не являются экологически чистыми согласно современным требованиям [4].

Поэтому ежегодно различными перерабатывающими предприятиями вывозятся на свалку,

поля фильтрации, овраги, спускаются в пруды и реки более 2 млрд тонн так называемых отходов: послеспиртовой барды, отработанных дрожжей и т. д. Многие из них, к сожалению, до настоящего времени не находят рационального применения в промышленности [7].

Б связи с этим важной задачей является проведение исследований по созданию безотходных технологий, позволяющих комплексно использовать отходы и сводить до минимума вред, наносимый окружающей природной среде [1].

В настоящее время разработаны немногочисленные технологии утилизации послеспиртовой барды с получением кормовых дрожжей, упаренной обессоленной барды на корм скоту, кормового витамина В]2, глутаминовой кислоты, глутамата натрия, глутамата калия, бетаина нейтрального, глицерина. Упаренная послеспиртовая барда — исходное сырье для производства гранулированного органо-минерального удобрения. Также она используется как пластификатор бетона, разжижитель сырьевого шлама для производства цемента [6]. Одной из основных проблем использования барды на корм скоту является большое количество клет чатки, вследствие чего она плохо усваивается животными. В то же время лигнолити-ческие грибы, в частности Panus (Lentinus)

мощным

*6

(лигно- и целлюлозоразрушающим) комплек сом, позволяющим одновременно утилизировать клетчатку и наращивать белковую биомассу. Комплексная переработка жидкой барды грибами-базидиомицетами позволяет создать полноценный витаминизированный белково-углеводный корм, в связи с чем важным технологическим моментом является получение максимального выхода белка и биомассы.

В своей работе мы исследовали влияние важного технологического параметра — pH — на рост и накопление белка грибом Partus (Lentinus) tigrinus при жидкофазном культивировании. на послеспиртовой барде.

Методика. Объектом исследования служил лигнолитический гриб Panus (Lentinus) tigrinus BKMF-3616D, выделенный сотрудниками кафедры из сухих плодовых тел, растущих на березовом валежнике в окрестностях г. Саранска, и послеспиртовая барда, полученная с ОАО «Мордовспирт».

Штаммы гриба поддерживали на косяках с сусло-агаром. Для приготовления инокулята грибов штаммы выращивали в течение семи суток на жидкой среде Чапека — Докса с добавлением 1,5 % лигносульфаната.

Выращивание инокулята вели в колбах объемом 500 мл, куда наливали 100 мл среды, в перемешиваемых условиях на качалках при 160 об / мин при 26 °C. Засев проводили кусочком агара, заросшего культурой гриба (приблизительно 1 х 1 см).

Инокулят вносили по 5 мл на 100 мл питательной среды. Выращивание культуры гриба проводили на послеспиртовой барде с различными значениями pH в перемешиваемых условиях на качалке (200 об / мин) при 26 °C в течение 12 суток.

Измерения проводили на 3-и, Be, 9-е и 12-е сутки роста гриба. Внеклеточный белок в культуральной жидкости определяли по методу Бредфорда, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (2]. Биомассу определяли по сухому весу. Высушивание проводили при 105 °C до постоянного веса.

Все опыты повторяли трижды. Статистическую обработку проводили по данным всех опытов по стандартным методикам с использованием программы BIOSTAT.

Результаты. Исследования по влиянию начального pH нативной барды на рост и накопление белка грибом Panus (Lentinus) tigrinus выявили следующие закономерности (табл. 1).

Таблица /

Влияние pH послеспиртовой барды на рост гриба Panus ( Lentinus) tigrinus BKMF-3616D

Варианты	Биомасса, г/л
	3	6	9	12
pH 4,0	30,54 ±2,65	41,99 ±3,71	25,66 ±0,20	21,15 ± 2.12
pH 5,0	28,29 ±0,98	26,65 ±2,31	15,80 ± 1,30	11.93 ± 1,19
pH 6,0	26,17 ±2,02	19,44 ± 1,54	18,08 ± 1,68	7,55 ± 0,76
pH 7,0	22,02 ± 1,30	22,60 ± 1,34	21,58 ± 1,68	9,97 ± 0,98

Как видно из табл. 1, при всех вариантах нашего исследования обнаружена сходная картина изменения биомассы. Так, во всех вариантах наблюдалось резкое увеличение количества биомассы уже к 3-м суткам культивирования (трофофаза развития грибов), что связано с началом интенсивного поглощения питательных веществ грибом из барды и, как следствие, с переходом к логарифмическому росту биомассы. При этом максимальное накопление биомассы к 3-м суткам наблюдалось при pH 4,0 — 6,0 ( в среднем 28 г/л). Дальнейшее культивирование до 6-х суток привело практически во всех вариантах к стационарному состоянию биомассы (идио-фаза развития гриба). Только в варианте с pH 4,0 происходит дальнейшее увеличение выхода биомассы до 42 г/л (почти в 1,5 раза).

Как известно из литературных данных максимальную продуктивность по биомассе культивируемые в искусственных условиях микроорганизмы дают при своих оптимальных значениях pH, отклонение от которых в любую сторону ведет к снижению скорости роста. Негативные последствия изменения pH обусловлены прямым и косвенным дей ствием ионов водорода на клетку. Прямое действие направлено непосредственно на клеточные структуры, косвенное — на компоненты внешней среды, а через них — на клетку. Изменение pH во внешней среде может снизить каталитическую активность экзоферментов, осуществляющих гидролитическое расщепление макромолекул питательных веществ. Концентрация протонов во внешней среде влияет на величину электрического заряда поверхности клетки и электрического потенциала мембраны. Поскольку плазмалем-ма трудно проницаема для гидроксильных ионов и протонов, внеклеточная и внутриклеточная концентрация последних не уравновешиваются между собой, благодаря чему создается трансмембранный градиент ионов водорода, который совместно с электрическим потенциалом мембраны управляет мембранными реакциями [4 — 8].

Культивирование до 12-х суток роста приводило уже к резкому (в 2 — 3 раза) снижению биомассы, что связано с началом лизиса биомассы после 6-х суток роста.

Параллельно с изменением биомассы мы определяли внеклеточный белок (табл. 2).

Таблица. 2

Влияние pH послеспиртовой барды, на накопление белка грибом Panos (Lentinus) tigrinus BKMF-36I6D

Варианты	Внеклеточный Ьелок, г/л
	3	6	9	12
pH 4,0	0,183 ±0,016	О,199±О.О18	0,671 ±0,057	0,650 ± 0,060
pH 5.0	0,195 ±0,012	0,303 ± 0.030	0,233 ±0,021	1,727 ±0,163
pH 6.0	0.261 ±0,021	0,410 ±0,041	0,469 ± 0,043	1,548 ±0,144
pH 7,0	0,148 ±0,012	0,809 ± 0,080	0,604 ±0,058	1,797 ±0,169

Анализ полученных данных показывает, что максимальное количество внеклеточного белка образуется на 12-е сутки при начальном pH 5,0 — 7,0. Общая динамика образования грибом внеклеточного белка идет по одинаковой схеме: небольшое количество в начале культивирования и увеличение белка к 12-м суткам роста.

Сопоставление динамики накопления биомассы и белка позволяет сделать предположение, что резкое увеличение количества внеклеточного белка связано не с синтезом, а скорее с распадом клеток биомассы, так как в этих же вариантах к 12-м суткам количество биомассы снижается в 2 — 2,5 раза, вероятно, за счет автолиза, что и объясняет довольно высокий выход белка. Также это связано с тем, что в исходной барде содержится протеин (в зависимости от вида сырья разное его количество); при определении внеклеточного белка, образуемого грибом, определялся и белок, содержащийся в исходной барде.

Таким образом, оптимальным вариантом, приводящим к максимальному накоплению биомассы к 6-м суткам роста, является вариант с начальным pH 4,0. А оптимальным вариантом, стимулирующим максимальное накопление белка, являются варианты с pH 5,0 — 7,0.