Влияние наночастиц металлов на чувствительность к антибиотикам клинических штаммов Escherichia coli

В настоящее время устойчивость микроорганизмов к антибиотикам представляет серьезную проблему. Ежегодно в странах Европейского союза около 25 тыс. человек умирают от инфекций, вызванных антибиотикорезистентными штаммами микроорганизмов [Draft guidelines…, 2010].

Основными генетическими механизмами формирования резистентности у микроорганизмов являются модификация собственных генов, кодирующих мишень действия антибиотиков в клетке, а также приобретение новых генетических элементов (плазмиды, транспозоны и др.). В последнее время наряду с поиском альтернативных антибактериальных средств актуален вопрос о разработке средств, препятствующих селекции антибиотико-резитстентных штаммов микроорганизмов, также способствующих повышению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

В ряде работ предложены способы повышения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам путем воздействия различных средств и химических препаратов, протеолитических бактериальных ферментов, ферментов животного происхождения [Средство для повышения чувствительности…, 2003, 2004, 2005].

В настоящее время в литературе описано 3 механизма антибактериального действия наночастиц металлов, один из которых заключается в поглощении клеткой ионов металлов, приводящих к на- рушению репликации и разрушению молекулы ДНК. Генотоксическое действие наночастиц металлов может быть направлено не только на ДНК нуклеоида, но и на дополнительные внехромосом-ные генетические элементы бактериальной клетки, такие как R-плазмиды, несущие основную генетическую информацию о приобретенной устойчивости микроорганизмов. Такой механизм действия наночастиц металлов может привести к разрушению плазмидной ДНК бактериальной клетки и как следствие к восстановлению антибиотикочувстви-тельности микроорганизма [Kotra et al., 1999; Lok et al., 2006; Kim et al., 2007; 8, Quillan, 2010].

В связи с вышесказанным целью исследования явилось изучение антибиотикочувствительности клинических штаммов микроорганизмов до и после воздействия наночастиц металлов.

Материалы и методы

В работе использовали наночастицы переходной группы металлов: меди, никеля, титана и марганца (ТУ 1733-056-00209013-2008), синтезированные на плазмохимическом комплексе филиала ФГУП РФ «Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии элементоорганических соединений» (ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС г. Москва). Наночастицы металлов характеризовались следующими физико-химическими свойствами: наночастицы меди – размер час-

тиц 75.71±3.11 нм, размер их агломератов – 114.6 нм, ζ-потенциал – 34.7 мВ, в состав поверхности наночастиц меди входит 26.58% кислорода, 8.88% углерода, 9.44% железа и 55.11% меди; размеры наночастиц никеля – 80.51±2.21 нм, размеры агломератов 1145 нм, ζ-потенциал – 3.51 мВ, в состав поверхности входит 7.72% кислорода, 12.29% серы, 15.84% бериллия и 64.15% никеля; размеры наночастиц титана – 42.86±2.21 нм, их агломератов – 1025 нм, ζ-потенциал – –13,9 мВ, в состав поверхности входит 37.93% кислорода, 6.12% серы, 10.46% углерода и 45.49% титана; размер наночастиц марганца – 68.71±4.12 нм, их агломератов – 912.1 нм, ζ-потенциал – 2.92 мВ, в состав поверхности входит 36.17% кислорода, 7.54% серы, 17.07% углерода и 39.22% марганца.

В исследовании использовали 20 штаммов Escherichia coli , выделенных от больных травматолого-ортопедического профиля с посттравматическими и послеоперационными осложнениями, находившихся на лечение ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздрава России.

Изучение изменения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам после воздействия наночастиц металлов проводили по нижеизложенной методике.

Готовили взвеси наночастиц металлов путем их внесения в 0.9%-ный раствор хлорида натрия до достижения концентрации 0.01 мг/мл. Смешивали 850 мкл взвеси наночастиц металлов с 50 мкл 0.1%-ного раствора ЭДТА (рН 7.2–7.4) (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, С 10 Н 14 О 8 N 2 Nа 2 ∙2Н 2 О) (Панеко, Россия). В приготовленную смесь добавляли 100 мкл взвеси микроорганизмов.

В качестве контроля использовали 0.9%-ный раствор хлорида натрия и смесь 0.9%-ного раствора хлорида натрия и ЭДТА. В контрольные пробирки вносили 100 мкл взвеси микроорганизмов и инкубировали в термошейкере (Sky Line ST-3 (ELMI, Латвия)) при 150 об/мин. и температуре 37°С в течение 60 мин.; 100 мкл полученной биомассы высевали на агаризованную питательную среду и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 18–24 ч. На следующей день просматривали чашки с выросшей культурой и определяли чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. В исследовании использовали питательную среду Mueller-Hinton-Agar (Becton Dickinson, США) и сенси-диски с антибиотиками (Becton Dickinson, США).

Для всех исследуемых штаммов микроорганизмов до и после воздействия наночастиц металлов определен условный коэффициент резистентности по следующей формуле

K=R, N где K – коэффициент резистентности; R – количество антибиотиков, к которым исследуемый штамм резистентен (в том числе с промежуточной чувствительностью); N – общее число антибактериаль- ных препаратов, принятых в исследование.

Показатели коэффициента позволяют судить об относительной интегральной резистентности штаммов микроорганизмов к используемым в исследовании антибактериальным препаратам. Полученные показатели варьируют от 0 до 1. Нулевой показатель означает отсутствие резистентности у исследуемых штаммов микроорганизмов, 1 – наличие устойчивости ко всем препаратам, принятым в исследование [Гостев, Науменко, Мартель, 2010].

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 6.0 [Реброва, 2006]. Взаимосвязь качественных признаков устанавливали путем выявления взаимной сопряженности. Для достижения поставленной цели рассчитан критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. Интерпретация результатов основывалась на следующем:

• -    если р>0.05, то нулевую гипотезу об отсутствии различий между группами по частоте признаков не отвергают;

• -    если р<0.05, то следует отклонить нулевую гипотезу и принять альтернативную гипотезу о существовании различий между группами по частоте изучаемого признака.

Результаты

Формулы набираются в редакторе Microsoft Equation с выравниванием по центру и пробелами сверху и снизу по 6 пт (номер формулы, если формул несколько, выравнивается по правому краю колонки):

Все штаммы E. coli , включенные в работу, подлежали исследованию на чувствительность к 13 антибактериальным препаратам 3 классов. В результате проведенного исследования установлен высокий уровень резистентности штаммов E. coli к профильным антибиотикам. Анализ данных показал устойчивость 19 из 20 исследуемых штаммов к 5 и более антибактериальным препаратам.

Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам различных групп продемонстрирована на рисунке.

Как видно из рисунка, все исследуемые штаммы E. coli устойчивы к ингибиторозащищенному пенициллину (амоксициллин/клавуланату), 19 штаммов – к пенициллину расширенного сектра действия (ампициллину). Резистентность к цефалоспоринам определена у 17 штаммов микроорганизмов. Так, 17 штаммов оказались не чувствительными к цефазолину и цефтриаксону, 16 – к цефепиму, 14 – к цефтазидиму, 13 – к цефотаксиму и цефоперазону. Кроме того, 1 из исследуемых штаммов обладал промежуточной чувствительностью к цефазолину, 1 – к цефотаксиму, 1 – к цефтазидиму, 2 – цефоперазону. Выявлена устойчивость штаммов E. coli к аминогликозидам (13

штаммов показали устойчивость к амикацину, 10 – к гентамицину). Наиболее высокая активность в отношении штаммов E. coli наблюдалась у карба-пенемов (13 штаммов чувствительны к имипенему и меропенему) и хинолонов (12 штаммов чувствительны к ципрофлоксацину).

Антибиотикорезистентность клинических штаммов Escherichia coli

Изучено влияние наночастиц меди, никеля, титана и марганца на антибиотиотикочувствитель-ность клинических штаммов E. coli . В исследование включены две контрольные группы микроорганизмов, не подвергавшихся воздействию наночастиц металлов. В первой контрольной группе микроорганизмы инокулировали в 0.9%-ный раствор хлорида натрия, во второй – в 0.9%-ный раствор хлорида натрия с добавлением ЭДТА.

хлорида натрия с добавлением ЭДТА. Проведенный анализ результатов показал отсутствие статистически достоверных различий между контрольными группами исследования; в связи с этим сочли возможным объединить их в одну группу, и в дальнейшем показатели опытных групп сравнивали с усредненной цифрой. Полученные результаты представлены в таблице.

Устойчивость к антибиотикам клинических антибиотикорезистентных штаммов Escherichia coli

Антибиотик	Количество штаммов, устойчивых к антибиотику
	Контроль с 0.9% раствором хлорида натрия (n=20)	Контроль с ЭДТА (n=20)	Усредненный контроль	НЧ меди (n=20)	НЧ никеля (n=20)	НЧ титана (n=20)	НЧ марганца (n=20)
Ампициллин	19	19 χ2 1 =0.53; p 1 =0.47	19	8 χ2 2 =11.40; p 2 =0.0007	18 χ2 2 =0; p 2 =1.0000	19 χ2 2 =0.53; p 2 =0.4682	19 χ2 2 =0.53; p 2 =0.4682
Амоксициллин/ клавуланат	20	20 χ2 1 =0.0; p 1 =1.0000	20	11 χ2 2 =9.18; p 2 =0.0025	17 χ2 2 =1.44; p 2 =0.2299	20 χ2 2 =0; p 2 =1.0000	20 χ2 2 =0; p 2 =1.0000
Цефазолин	18	18 χ2 1 =0.28; p 1 =0.5982	18	18 χ2 2 =0.28; p 2 =0.5982	18 χ2 2 =0.28; p 2 =0.5982	17 χ2 2 =0; p 2 =1.0000	18 χ2 2 =0.28; p 2 =0.5982
Цефотаксим	14	14 χ2 1 =0.12; p 1 =0.7301	14	13 χ2 2 =0; p 2 =1.0000	14 χ2 2 =0.12; p 2 =0.7301	14 χ2 2 =0.12; p 2 =0.7301	14 χ2 2 =0.12; p 2 =0.7301
Цефтриаксон	17	17 χ2 1 =0.20; p 1 =0.6579	17	17 χ2 2 =0.20; p 2 =0.6579	17 χ2 2 =0.20; p 2 =0.6579	17 χ2 2 =0.20; p 2 =0.6579	17 χ2=0.20; p 2 =0.6579
Цефтазидим	15	15 χ2 1 =0.13; p 1 =0.7150	15	14 χ2 2 =0; p 2 =1.0000	15 χ2 2 =0.13; p 2 =0.7150	15 χ2 2 =0; p 2 =1.0000	15 χ2 2 =0; p 2 =1.0000
Цефоперазон	15	15 χ2 1 =0.13; p 1 =0.7150	15	15 χ2 2 =0.13; p 2 =0.7150	14 χ2 2 =0; p 2 =1	15 χ2 2 =0.13; p 2 =0.7150	15 χ2 2 =0.13; p 2 =0.715
Цефипим	16	16 χ2 1 =0.16; p 1 =0.6926	16	16 χ2 2 =0.16; p 2 =0.6926	16 χ2 2 =0.16; p 2 =0.6926	16 χ2 2 =0.16; p 2 =0.6926	16 χ2 2 =0.16; p 2 =0.6926

Окончание таблицы

Количество штаммов, устойчивых к антибиотику

Антибиотик	Контроль с 0.9% раствором хлорида натрия (n=20)	Контроль с ЭДТА (n=20)	Усредненный контроль	НЧ меди (n=20)	НЧ никеля (n=20)	НЧ титана (n=20)	НЧ марганца (n=20)
Имипенем	7	7 χ2 1 =0.14; p 1 =0.7055	7	7 χ2 2 =0.14; p 2 =0.7055	7 χ2 2 =0.14; p 2 =0.7055	7 χ2 2 =0.14; p 2 =0.7055	7 χ2 2 =0.14; p 2 =0.7055
Меропенем	7	7 χ2 1 =0.14; p 1 =0.7055	7	7 χ2 2 =0.14; p 2 =0.7055	7 χ2 2 =0.14; p=0.7055	7 χ2 2 =0.14; p 2 =0.7055	7 χ2 2 =0.14; p 2 =0.7055
Гентамицин	10	10 χ21=0.10; р1=0.7518	10	0 χ22=10.80; р2=0.001	10 χ22=0.10; р2=0.7518	10 χ22=0.10; р2=0.7518	10 χ22=0.10; P=0.7518
Амикацин	13	13 χ21=0.11; p1=0.7403	13	12 χ22=0; p2=1.0000	11 χ22=0.10; p2=0.7469	13 χ22=0.11; p2=0.7403	13 χ22=0.11; p2=0.7403
Ципрофлоксацин	8	8 χ21=0.11; p1=0.7403	8	6 χ22=0.11; p2=0.7403	7 χ22=0; p2=1.0000	8 χ22=0.11; p2=0.7403	8 χ22=0.11; p2=0.7403

Примечание. χ2 – критерий с поправкой Йетса на непрерывность, р – показатель достоверности, χ21p1 – по срав- нению с группой контроля с 0.9%-ным раствором хлорида натрия, χ22p2 – по сравнению с группой усредненного контроля, n – количество наблюдений.

В результате проведенных исследований обнаружены статистически значимые изменения чувствительности клинических штаммов микроорганизмов после воздействия суспензии наночастиц меди в концентрации 0.01 мг/мл в течение 30 мин. к ампициллину, амиксициллину/клавуланату и гентамицину. Как видно из таблицы, у 11 из 19 резистентных к ампициллину штаммов чувствительность восстановилась к ампициллину (χ²= 11.40; p= 0.0007), у 9 из 20 – к амиксицилли-ну/клавуланату (χ²= 9.18; p= 0.0025). Кроме того, отмечено восстановление чувствительности к гентамицину всех 10 изначально резистентных клинических штаммов E. coli (χ²= 10.80; p= 0.001). Статистически достоверных изменений после воздействия наночастицами никеля, титана и марганца не обнаружено.

По результатам проведенных исследований рассчитан коэффициент резистентности клинических штаммов E. coli до и после воздействия наночастиц металлов. Полученные результаты позволяют судить об относительной интегральной устойчивости штаммов микроорганизмов к включенным в исследование антибиотикам. В контрольной группе микроорганизмов коэффициент резистентности составил 0.69±0.04. После воздействия наночастиц меди отмечено статистически значимое (р<0.05) снижение показателя до 0.55±0.04, что говорит о повышении чувствительности микроорганизмов к ряду исследуемых препаратов. После воздействия наночастиц никеля, титана и марганца статистически значимых различий с контрольной группой микроорганизмов не наблюдалось. Коэффициент резистентности клинических штаммов E. coli после воздействия наночастиц никеля составил 0.63±0.04, титана – 0.69±0.04, марганца – 0.69±0.04.

Заключение

В результате проведенного исследования установлено, что наночастицы меди способны восстанавливать чувствительность штаммов E. coli к некоторым бета-лактамным антибиотикам (ампициллину, амоксициллину/клавуланату) и аминогликозидам (гентамицину). Можно предположить, что наночастицы меди оказывают генотоксическое действие в отношении грамотрицательных микроорганизмов, способствующее восстановлению чувствительности штаммов E. coli к протии-вомикробным препаратам. Гены, ответственные за формирование резистентности к антибактериальным препаратам этих групп, в основном локализованы на плазмидной ДНК. В связи с этим можно предположить, что действие наночастиц меди в данном случае направлено именно на R-плазмиды бактериальной клетки, несущие гены, ответственные за формирование устойчивости к антибиотикам данных групп.

Воздействие наночастиц никеля, титана и марганца в концентрации 0,01 мг/мл в течение 30 мин. не приводило к статистически достоверным изменениям антибиотикочувствительности клинических штаммов E. coli .

На основании полученных данных разработан Способ повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (патент РФ № 2529367, приор. от 19.04.2013 г.).