Влияние наноразмерной формы 20-гидроксиэкдизона на белковый обмен, рост и развитие крыс Wistar

Экдистероиды относятся к классу стероидных соединений фауны и флоры и благодаря своим уникальным свойствам, физиологической активности вызывают интерес у исследователей разных стран. В природе экдистероиды синтезируются беспозвоночными для контроля процессов, сопровождающихся сложной перестройкой организма, таких как линька, метаморфоз, диапауза (зооэкдистероиды). Со- единения экдистероидной природы широко представлены и в растениях, так называемые фитоэкдистероиды (ФЭ). В основном из них представлены экдизон и 20-гидроксиэкдизон (20-Е).

Они различаются гидроксильной группой в 20-м положении [6]. Ниже представлена эмпирическая и структурная формулы, а также молекулярная масса 20Е:

OH

Рисунок 1 – Эмпирическая формула: С27Н44О7, молекулярная масса: 480,64

В настоящее время ведутся интенсивные исследования ФЭ, в частности их свойств регулировать процессы метаболизма в организме [2]. Экспериментальные данные свидетельствуют, что 20-Е является адаптогеном, который ассоциируется с ее анаболической активностью: повышение массы тела и общего количества белка в почках, сердце и печени [1]. Широкий спектр физиологических эффектов 20-Е в сочетании с его безопасностью может быть основанием для практического применения, как в качестве индивидуального средства, так и в составе композиций. Особенно важным и интересным является свойство 20-Е регулировать физиологические функции при различных патологических состояниях и метаболические процессы в организме [2]. По данным зарубежных авторов [9, 10] 20-Е повышает биосинтез белков путем активации сигналов через PKB/Akt (протеинкиназа B/Akt, киназа

RAC-альфа, серин/треониновая протеин-киназа) на мишень комплекса рапамицин 1 (mTORC1).

Вместе с тем не исследованы проблемы направленные на повышение растворимости в различных средах, улучшение биологической доступности, снижение предлагаемых доз для практического применения и пролонгации действия 20-Е. Для решения выше указанной проблемы приемлемым является создание наноразмер-ной формы 20-Е на основе получения клатратных комплексов с клатратообразова-телями (циклодекстирины, арабиногалактан и гуммиарабик и др.) с применением твердофазного и жидкофазного методов синтеза. Клатратные комплексы 20-Е с клатратообразователями позволяют улучшить их физико-химические свойства, что может в разы повысить растворимость в водных средах и биологическую доступность и, в конечном итоге, обеспечить снижение эффективных доз для практического применения в медицине, ветеринарии [8]. В связи с этим актуальным является создание растворимой, биодоступной наноразмерной формы 20-гидроксиэкдизона и изучение ее влияния на процессы белкового обмена, роста и развития животных.

Целью работы было создание и исследование влияния наноразмерной формы 20-гидроксиэкдизона на метаболизм белков, рост и развитие у крыс Wistar.

Материал и методы исследований. Клатратный комплекс 20-Е (нанораз-мерная форма) с арабиногалактаном создавался с применением способа твёрдофазного синтеза на шаровой мельнице Активатор 2S с материалом помольных стаканов из корунда и шаров из оксида циркония диаметром 3, 5 и 10 мм. Измерение размера полученных частиц проведено на приборе Zetasizer Nano ZS.

Эксперимент по изучению влияния разработанного наноразмерного 20-Е на рост, развитие и белковый обмен проведен на 110 крысах – самцах и самках линии Wistar. Масса крыс составляла в начале эксперимента 147-149 г (самки) и 150-166 г (самцы). Эксперимент продолжался до достижения массы тела крыс 226-237 г

(самки) и 290-314 г (самцы). Было сформировано 4 группы крыс обоего пола: три по 15 крыс и одна группа интактных животных по 10 особей. Животным 1 группы (контроль) в течение месяца вводили внутрижелудочно суспензию арабиногалактана в крахмальном геле; 2 группы – клатратный комплекс 20-Е с арабиногалактаном в дозе 1,0 мг/кг массы тела; 3 группы – клатратный комплекс 20Е с арабиногалактаном в дозе 5,0 мг/кг массы тела. Группам интактных животных ничего не вводилась. За животными вели постоянное клиническое наблюдение. С учетом половой принадлежности крыс содержали в отдельных клетках по 5 животных. Условия содержания животных были идентичными во всех группах. Животные получали одни и те же корма, имели свободный доступ к воде. Все исследовательские работы с крысами проведены в соответствии с общепринятыми этическими нормами обращения с животными, на основе стандартных операционных процедур (СОП), которые соответствуют правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных, используемых для исследовательских и иных научных целей [4].

В целях оценки интенсивности роста и развития подопытных крыс перед постановкой эксперимента, а далее на 15 и 30 сутки проводили их взвешивание. По результатам взвешиваний рассчитывали:

• 1)    Абсолютный прирост массы тела (А (г) = М кон. - М нач.);

• 2)    Среднесуточный прирост массы тела (С/c (г) = М кон. - М нач. / Т);

• г) Относительный прирост массы тела в процентах по формуле Броди:

О = М кон. - М нач. / (М кон. + М нач.) × 0,5 × 100 %, где М нач. – начальная масса тела крыс; М кон. – конечная масса тела крыс; Т – продолжительность эксперимента в сутках.

В конце эксперимента для анализа показателей белкового метаболизма, крыс усыпляли внутрибрюшинным введением тиопентала натрия в дозе 60 мг/кг массы тела, кровь брали с помощью шпри- ца из задней полой вены и далее ее переносили в полипропиленовые пробирки без антикоагулянтов с целью получения сыворотки крови.

Для характеристики потребления, экскреции из организма азота и оценки его абсорбции и ретенции в конце эксперимента провели в течение 5 суток сбор и учет съеденного корма, кала и мочи крыс-самцов в метаболических клетках у 6 животных из каждой группы.

Для оценки белкового обмена у крыс в сыворотке крови на автоматическом биохимическом анализаторе АРД 300 были определены: общий белок и альбумин – биуретовым методом; концентрация мочевины диацетилмонооксимным методом с помощью набора UREA 450 «Лахема» [10]; активность ферментов аспартатаминотрансферазы (АСТ) (КФ 2.6.1.1.), аланинаминотрансферазы (АЛТ) (К.Ф. 2.6.1.2.), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) (К.Ф. 2.3.2.2.), содержание креатинина определяли с использованием наборов UTS («Юнимед»). Образцы корма и кала анализировали на содержание сухого вещества общеизвестным методом. В образцах корма, кала и мочи определяли содержание азота по Къельдалю.

Статистическая обработка результатов исследований была проведена с применением параметрических (t-критерия) и непараметрических методов (U-критерия). Различия между группами считались статистически значимыми при Р <0,05 [5].

Результаты исследований. В результате проведенных исследований получен новый клатратный комплекс 20-Е с арабиногалактаном при массовом соотношении 20-Е: арабиногалактан 1:10. Полученный клатратный комплекс имеет кристаллическую форму и выделен в виде наночастиц мелкодисперсного подвижного порошка светло жёлтого цвета со средним размером частиц 35,3 нм.

Результаты физиологических исследований по балансу азота показали, что введение наноразмерной формы 20-Е способствует более эффективному использованию азотистых веществ корма по сравнению с контролем. У крыс опытных групп по сравнению с контролем отмечалось снижение экскреции азота с мочой (на 14,3 и 10,7 %, Р <0,05 и Р <0,04) на фоне почти идентичной его абсорбции. В конечном итоге ретенция азота была выше на 18,2 % (Р <0,02) у крыс опытных групп по сравнению с контролем. При этом использование азота как от принятого, так и от переваренного было выше у крыс опытных групп. Следует отметить, что более эффективное использование азота корма у крыс опытных групп по сравнению с контролем складывалось за счет снижения мочевино-образования и меньшего выделения ее с мочой, на что указывает статистически значимая низкая концентрация в сыворотке крови мочевины – конечного продукта азотистого обмена (Таблица 2). У крыс опытных групп концентрация мочевины в сыворотке крови была ниже на 31,3 и 29,3 % и 27,4 и 25,4 %, соответственно, по сравнению с контролем и интактными животными. Более интенсивное расходование аминокислот на синтез белков у крыс, которым вводилась наноразмерная форма 20Е в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг массы тела, способствовала тому, что меньшая их доля окислялась с образованием мочевины. В сыворотке крови у животных опытных групп по сравнению с контролем обнаружена статистически значимая повышенная концентрация креатинина (Таблица 1) – метаболита, в значительной мере являющегося индикатором массы скелетных мышц [3].

Как известно, общий белок сыворотки крови является жесткой генетической константой, и варьируется в определенном диапазоне. Снижение уровня белка в плазме крови на 1 г ведет к уменьшению его в тканях на 30 г. Однако снижение его уровня в сыворотке крови начинается лишь после исчерпания тканевых депо, где содержится 66 % всего пула общего белка. Белки являются и крайне «дорогими» в энергетическом плане: для транспорта одной аминокислоты в клетку требуется 3 АТФ, а для синтеза одной пептидной связи необходимо уже около 15 АТФ [2, 7]. Анализ белкового состава сыворотки крови свидетельствует, что введение нанораз-мерной 20-Е в двух дозах 1,0 и 5,0 мг/кг массы тела способствует повышению бе-локсинтезирующей активности организма по сравнению с контролем.

У крыс опытных групп содержание общего белка (на 6,5 и 7,3 %; Р <0,05), альбуминов (на 9,3 и 9,6 %; Р <0,05) и глобулинов было выше, чем в контроле (Таблица 1).

Таблица 1 – Показатели белкового обмена у самок крыс Wistar при введении наноразмерного 20-Е в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг массы тела (М±m, n=5)

Показатель	Группы
	Интактные животные	контроль	1-я опытная	2-я опытная
Самки
АСТ, Ед/л	176,2± 6,21	171,2± 5,13	180,8 ± 4,89	178,9 ± 4,44
АЛТ, Ед/л	52,6 ± 2,97	54,3± 2,54	47,3± 2,10*	46,0 ± 2,28*
ГГТ, Ед/л	9,4± 0,72	9,8 ± 0,59	7,9 ± 0,68*	7,7± 0,75*
АСТ+АЛТ/ГГТ	24,3	23,0	28,9	29,2
Мочевина, ммоль/л	5,24±0,35	5,53±0,36	3,80±0,14*****@	3,91±0,16*****@
Креатинин, мкмоль/л	35,1±0,76	34,3±0,85	37,2±0,99*	37,8±1,03**@
Общий белок, г/л	68,1±0,91	67,4±0,88	71,8±0,79*	72,3±0,85*
Альбумин (А), г/л	36,0±0,70	35,5±0,55	38,8±0,43*	38,9±0,50*
Глобулины (Г), г/л	32,1±0,32	31,9±0,29	33,0±0,34	33,4±0,41
Отношение А/Г	1,10	1,11	1,15	1,17

Р <0,001 по U-тесту при сравнении c контролем, @Р <0,001 по U-тесту при сравнении с группой интактных животных

Таблица 2 – Показатели роста и развития крыс Wistar при введении наноразмерного 20-Е в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг массы тела (М±m, n=15)

Показатель	Группы
	Интактные животные (n=10)	Контроль	1-я опытная	2-я опытная
Самки
Масса тела в начале, г	148,8±4,38	149,7±4,45	148,5±4,06	147,1±4,07
Масса тела в конце, г	226,2±3,96	225,5±4,02	237,4±3,70#	236,1±3,65
Абсолютный прирост массы тела, г	77,4±3,45	75,8±4,30	88,9±3,97#@	89,0±3,56#@
Среднесуточный прирост массы тела, г	2,58±0,11	2,53±0,19	2,96±0,12#@	2,97±0,14#@
Относительный прирост, %	52,02±2,20	50,63±3,11	59,87±2,87#@	60,50±2,68#@
Самцы
Масса тела в начале, г	166,1±4,96	152,0±5,10	150,5±5,43	154,6±6,96
Масса тела в конце, г	305,6±4,89	289,5±5,75	305,3±5,81#	313,6±7,90##
Абсолютный прирост массы тела, г	139,5±4,41	137,5±5,89	154,8±6,24#@	159,0±7,70##@@
Среднесуточный прирост массы тела, г	4,65±0,16	4,58±0,17	5,16±0,20#@	5,30±0,27#@
Относительный прирост, %	59,2±3,15	62,3±1,9	67,9±2,01#@	67,9±2,09#@

#Р <0,05; ##Р <0,01по t-тесту при сравнении c контролем; @Р <0,05; @@Р <0,03 по t-тесту при сравнении c группой интактных животных

Как известно соотношение активности ферментов АСТ и АЛТ определяет интенсивность метаболических потоков, а также сохранение важнейших (глюкоза и белок) констант. Поэтому, оценка биохи- мических показателей должна учитывать, прежде всего, метаболические взаимосвязи, а не цитолитические проявления. Метаболическое благополучие (верхний уровень белка) достигается энзимологически- ми сдвигами, и это хорошо иллюстрирует отношение трансаминаз к ГГТ, минимальное именно в критической (нижний уровень белка) зоне общего белка. Обеспеченность аминокислот за счет тканевого пула должна оцениваться через соотношение АСТ+АЛТ/ГГТ, т.е. субстратов для катаболизма в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) или анаболизма в глюконеогенезе при жесткой их координации. И так же, как соотношение трансаминаз – это признак физиологической координированности ката- и анаболизма, так и их суммарное отношение к ГГТ указывает на эффективность вспомогательного резервного тканевого транспорта. Это и есть признаки выявления метаболической взаимосвязи показателей. Низкий белок компенсируются более высоким уровнем активности ГГТ [7].

По данным активности АСТ, АЛТ и ГГТ и их соотношению, введение нано-размерной формы 20-Е в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг массы тела обеспечивает более эффективное использование аминокислот на биосинтез и отложение белков в организме (Таблица 1).

В конечном итоге изменения в интенсивности и направленности в белковом обмене, вызванные воздействием нанораз-мерной формы 20-Е, способствовали улучшению роста и развития крыс. У крыс (обоего пола) опытных групп по сравнению с контролем и интактными животными статистически значимо были выше показатели абсолютного среднесуточного и относительного прироста массы тела (Таблица 2).

Заключение. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что введение крысам Wistar наноразмерного 20-Е в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг массы тела способствует более интенсивному протеканию метаболизма и биосинтеза белков, повышению их роста и развития.

При этом наилучшие результаты получены при введении наноразмерной формы 20-Е в дозе 1,0 мг/кг массы тела крыс.

Резюме

В представленной работе изучено влияние созданной наноразмерной формы 20-гидроксиэкдизона на белковый обмен, рост и развитие крыс Wistar. В результате проведенных исследований показано, что введение крысам наноразмерной формы 20-гидроксиэкдизона в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг массы тела обеспечивает более эффективное использование аминокислот на биосинтез и отложение белков в их организме. Ретенция азота у крыс опытных групп по сравнению с контролем увеличилась на 18,2 % (Р<0,02). У крыс (обоего пола) опытных групп по сравнению с контролем и интактными животными статистически значимо были выше показатели их роста и развития. При этом оптимальной дозой наноразмерной формы 20-гидроксиэкдизона является доза 1,0 мг/кг массы тела крыс.