Влияние низкомолекулярного хитозана на регенерацию полнослойной гнойной раны в эксперименте

Одним из актуальных направлений в медицине, в том числе - хирургии, является разработка био-совместимых, биодеградируемых и обладающих низкой токсичностью раневых покрытий, предназначенных для применения в условиях гнойного воспаления мягких тканей. В данном контексте рассматривается возможность использования различных композиций на основе природного биополимера хитозана [Марквичева, 2002]. Биодеградация полимерных носителей на его основе при воздействии неспецифических ферментов является одним из основных преимуществ [Чернова и др., 2009]. Кроме того, известны антибактериальные и регенерирующие [Регенерирующая ..., 2005; Бауэр и др., 2011] эффекты данного полимера.

Актуальным представляется оценка влияния местного применения гидрогеля хитозана на динамику заживления полнослойной кожной раны, осложненной гнойным процессом, вызванным клиническими полиантибиотикорезистентными штаммами Staphylococcus aureus [Бесчастнов и др., 2009; Божкова, 2011]. Выбор в качестве объекта для воздействия грамположительных кокков St. aureus, как транзиторного так и облигатного происхождения, обоснован широкой его распространенностью и преобладанием в структуре послеоперационных раневых инфекций [Гайдуль, Муконин, 2005].

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение репаративной регенерации мягких тканей при использовании гидрогеля природного биополимера хитозана в условиях экспериментальной гнойной раны.

Материалы и методы

Исследование проводили на 60 белых беспородных крысах - половозрелых самцах, массой тела 190-240 г.

Животные содержались в отдельных боксиро-ванных помещениях, питание осуществлялось согласно стандартной диете. Все манипуляции производились в рамках Правил и рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Содержание животных, их питание и уход за ними проводились по «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 06.04.1973», эвтаназия экспериментальных животных осуществлялась согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение 3, 4 к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977, №755).

Формирование раны размером 20 х 20 мм осуществлялось в межлопаточной области животных

по предварительно нанесенному трафарету и представляло собой иссечение полнослойного кожного лоскута, сопровождаемое дополнительной механической травматизацией краев и дна раны [Van Sprang. Janssen, 2001]. Непосредственно после формирования раневой поверхности осуществлялось ее инфицирование путем зашивания в полученный дефект на 2 сут. марлевого тампона весом 0.5 г. пропитанного взвесью суточной культуры St. aureus. выделенной от пациентов с гнойными посттравматическими и послеоперационными осложнениями, в дозе 2-Ю⁶ КОЕ/мл. По истечении указанного срока были сняты швы и удален тампон. Все клинические и лабораторные признаки полнослойной раны с выраженным гнойным воспалением отмечали на 3-5 сут. [Гайдуль, Муконин, 2005].

В ходе эксперимента оценивали характер течения раневого процесса: наличие и особенности воспалительной реакции, состояние краев и дна раны, сроки очищения раны от некротических тканей, сроки появления грануляций и их особенности, сроки эпителизации ран. планиметрические характеристики на 3^ 5-. 7-. 10- и 14-е сутки. Всем животным были произведены исследования основных гемато-логических показателей с использованием гематологического анализатора Micros 60 АВХ (Франция), цитологические характеристики мазков-отпечатков ран. окрашенных («Лейкодиф» 200) с использованием микроскопа Revelation III (США), с подсчетом количества нейтрофильных лейкоцитов, макрофагов и фиброзных элементов из расчета на 100 клеток (иммерсионный объектив 10x100). а также бактериологических исследований обсемененности раневой поверхности с использованием микробиологического анализатора BD BBL Cristal Aytoreader. а также метода разведения с использованием стандартных сред.

Проводилось определение вязкости гидрогеля хитозана с помощью «SV-Ю Vibro -viscorer».

Экспериментальные животные были разделены на 3 группы по 20 крыс в каждой: 1 группа - интактные животные; 2 группа - опытная (животные с полнослойной гнойной раной, однократно покрытой гидрогелем хитозана; 3 группа - сравнения, животные с полнослойной гнойной раной, которую однократно обрабатывали 0.9%-ным изотоническим раствором хлорида натрия. Гидрогель хитозана готовили непосредственно перед нанесением на экспериментальную поверхность путем растворения навески хитозана массой 1 г в предварительно подогретом до 372^ стерильном изотоническом 0.9%-ном растворе натрия хлорида.

В работе был использован хитозан пищевой, произведенный ЗАО «БИОПРОГРЕСС»» г. Москва. Нанесение гидрогеля осуществлялось однократно равномерным слоем посредством накожной аппликации в количестве 1 г (рис. 1).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «Medstat», предназначенной для обработки результатов медицинских и биологических наблюдений.

Рис. 1. Экспериментальная рана с нанесенным гидрогелем хитозана

Результаты и обсуждения

На третьи сутки с момента формирования полнослойной гнойной раны у животных отмечено снижение веса и аппетита, уменьшение общей активности. При визуальном осмотре отмечалась гиперемия и отечность краев и дна раны, появление на ее поверхности экссудата, а у ряда животных (около 30%) от их общего числа - наличие гнойного отделяемого. У всех крыс опытной группы и группы сравнения при проведении бактериологического исследования констатировали наличие St. aureus в количестве не менее 3 10^s КОЕ/ мл.

У животных группы сравнения отмечалась гиперемия краев раны, наличие отдельных участков некроза, с частичным отторжением струпа, гнойным отделяемым (рис. 2).

Рис. 2. Экспериментальная гнойная рана у животного группы сравнения на 14-е сутки

К 14-м сут. отмечалась лишь частичная эпите-лизация и незначительная положительная динамика по уменьшению площади раны (табл. 1). Отмечено статистически значимое (р<0.05) уменьшение площади раны у животных опытной группы по сравнению с группой сравнения, уже начиная с 5-х сут. наблюдения. Данная тенденция сохранялась и в дальнейшем.

У крыс опытной группы после нанесения гидрогеля хитозана на раневую поверхность уже к 6-м сут. отмечено уменьшение площади поверхности раны, чем у крыс группы сравнения (табл. 1). На 10-е сут. отмечено отсутствие признаков воспаления и выраженное уменьшение площади раневой поверхности. На 14-е сут. после формирования полнослойной инфицированной раны у большинства животных опытной групп отмечалось формирование раневого струпа, состоятельная эпителизация. частичное восстановление волосяного покрова (рис. 3).

Таблица 1

Изменение площади раневой поверхности у экспериментальных животных

Сутки ис-следо-ва-ния	Группа сравнения, и =20	Применение гидрогеля хитозана, и = 20
1	396.3 ±5.4	399.2 ±5.8
3	368.8 ±7.3	353.6 ±7.1
5	329.1 ± 17.4	277.2 ± 11.4 р<0.05*
7	288.3 ± 18.4	202.1 ±23.5 р<0.01*
10	235.6 ±23.7	149.8 ±20.6 р<0.01*
14	195.3 ±23.6	88.9 ± 18.7 р<0.001*

* р - уровень достоверности различий показателей опытной группы по отношению к группе сравнения.

У оставшихся представителей опытной группы полная эпителизация и восстановление волосяного покрова имелись на 16-е сут.

В установленные сроки животным было произведено бактериологическое исследование отделяемого ран. У животных группы сравнения вплоть до завершения процесса эпителизации отмечалось выявление St. aureus от З ТО ⁶ КОЕ к 7-м суткам до 3 10’ КОЕ к 20-22-м суткам наблюдения. Кроме того, у 8 крыс была отмечена вторичная контаминация Е. coli в количестве 2 х 10⁴КОЕ.

Рис. 3. Экспериментальная гнойная рана у животного опытной группы

При исследовании раневого отделяемого у всех животных опытной группы в первые 14 дней наблюдения отмечалось наличие St. aureus в ране, средняя концентрация которого достигала ЗЮ³ КОЕ; в дальнейшем зафиксировано ее снижение. К моменту полного заживления ран (16-18-е сут.) лишь у 3 животных отмечалось наличие St. aureus в концентрации 3 10² КОЕ. Посевы с поверхности ран остальных животных опытной группы роста не давали.

В те же сроки производилась оценка лейкоцитарной формулы периферической крови, полученной при подрезании кончика хвоста (табл. 2).

Таблица 2

Динамика изменений содержания лейкоцитарной формулы у крыс различных групп

Сутки	Серия	Лейкоциты, общее содержание	П/я нейтр.	С/я нейтр.	Лимфоциты
3	Контрольная группа	11.7 ± 3.4-107л	3.3 ±0.8	25.1 ±3.7	67.4 ±6.9
	Группа сравнения	29.4 ± 5.2-107л	19.7 ± 1.7	38.1 ±2.1	39.1 ± 1.4
	Гидрогель хитозана	27.3 ±8. Г 107л	16.5 ± 1.2	40.8 ±2.3	39.0 ±3.7
5	Контрольная группа	10.2 ±2.8-107л	4.1 ± 1.1	23.3 ±2.8	69.3 ±5.1
	Группа сравнения	34.3 ± 12.3 107л	13.7 ± 1.6	32.1 ± 1.4	48.5 ±2.2
	Гидрогель хитозана	27.8 ±5.3-107л	11.0 ±0.8	38.6 ± 1.5 р< 0.001*	45.4 ±2.3
7	Контрольная группа	11.8 ±3.1 107л	3.7 ±0.9	21.3 ±2.8	65.4 ±7.3
	Группа сравнения	21.3 ±2.8- 107л	10.6 ± 1.2	32.0 ± 1.6	53.3 ±2.6
	Гидрогель хитозана	14.9 ±4.4-107л	6.2 ± 1.6 р<0.05*	29.8 ± 1.5	57.4 ± 1.5

* р - уровень достоверности различий показателей опытной группы по отношению к группе сравнения.

Динамика изменения цитологических характеристик раневых отпечатков представлена в табл. 3.

При изучении относительного содержания ключевых показателей лейкоцитарной формулы отме чена положительная динамика содержания сегментоядерных нейтрофилов в группе животных, получавших лечение гидрогелем хитозана по отношению к группе сравнения уже на 5-е сут. В те же сроки наблюдения у животных группы сравнения сохранялся дегенеративно-воспалительный тип цитограммы (рис. 4). Статистически значимые различия в содержании палочкоядерных нейтрофилов отмечены к 7-м сут.

Таблица 3 Цитологические показатели дна раневых отпечатков экспериментальных животных в различные сроки заживления

Показатели	Группа сравнения, п = 20	Опытная группа, п=20
1-е сут. наблюдения
нейтрофилы	97.6 ±7.2	93.5 ±6.3
макрофаги	2.1 ±2.3	0.9 ±2.3
фибробласты и фиброциты	1.1 ±2.9	2.1 ±0.9
З-и сут. наблюдения
нейтрофилы	89.3 ±3.9	93.4 ±6.4
макрофаги	10.1 ±7.3	7.6 ±2.1
фибробласты и фиброциты	0.9 ±3.9	1.1 ± 1.8
5-е сут. наблюдения
нейтрофилы	82.0 ± 1.9	79.8 ±2.3
макрофаги	10.0 ±7.6	10.2 ±6.2
фибробласты и фиброциты	6.9 ±4.9	8.1 ±4.8
7-е сут. наблюдения
нейтрофилы	76.1 ± 13.2	72.1 ±9.2
макрофаги	5.8 ±6.4	4.9 ±7.3
фибробласты и фиброциты	17.4 ±2.2	22.0 ±2.2
14-е сут. наблюдения
нейтрофилы	25.7 ±3.8	30.1 ± 1.8
макрофаги	8.9 ±6.2	12.2 ±2.3
фибробласты и фиброциты	63.2 ± 1.2	59.8 ±2.1

Рис. 4. Отпечаток гнойной раны у животного группы сравнения на 5-е сут. Скопление измененных нейтрофилов и микроорганизмов

Цитологическое исследование клеточного состава раневого дна показало наличие в течение первых суток развития патологического процесса, преобладание дегенеративно измененных сегментоядерных нейтрофилов в сочетании с элементами крови и нитями фибрина.

Если на 3-5-е сут. отмечалось преобладание измененных нейтрофилов, то к 9-м - неизмененных нейтрофилов, единичных лимфоцитов и моноцитов. что сопровождалось снижением экссудации и началом формирования грануляционной ткани. К 15-м сут. в препаратах обнаруживали профибробласты на фоне снижения содержания полиморфноядерных нейтрофилов до 19-22 в поле зрения.

Выводы

Результаты проведенного исследования свидетельствуют об антибактериальном и регенерирующем эффектах гидрогеля хитозана в условиях экспериментальной гнойной раны, вызванной клиническими полиантибиотикорезистентными штаммами St. aureus.