Влияние органических форм микроэлементов на морфологические изменения клеток щитовидной железы

Введение . Эссенциальные микроэлементы – это микроэлементы, регулярное поступление которых с пищей и водой в течение всей жизни организма необходимо для его нормального функционирования (йод, цинк, селен, железо и др.). Уровень поступления микроэлементов зависит от их содержания в пищевых продуктах и воде. Формирующийся в организме людей дефицит или избыток тех или иных микроэлементов приводит к эндемическим заболеваниям. Йод играет важную биологическую роль в организме, является важнейшим структурным элементом тиреоидных гормонов – трийодтиро-нина и тироксина. Недостаточное содержание в организме тиреоидных гормонов приводит к расстройству структурно-функциональных взаимосвязей нервной, сердечно-сосудистой, иммунной и других систем [1–3]. Гормоны щитовидной железы влияют на интенсивность процессов обмена веществ, регулируют температуру тела, укрепляют центральную нервную систему, а также оказывают воздействие на воспроизводительную способность человека и животных [4–6]. Как избыток, так и недостаток тиреоидных гормонов вызывает изменения сердечной сократимости, сердечного выброса, артериального давления и общего сосудистого сопротивления [7, 8].

Проблема микроэлементной недостаточности была и остается актуальной по настоящее время. Стратегией сегодняшнего дня принято компенсировать недостаток микроэлементов в рационе, и предпочтение отдается органическим формам. В связи с тем, что неорганические формы микроэлементов являются в ряде случаев несовместимыми между собой, характеризуются меньшей биодоступностью, в ряде случаев большей токсичностью, летучестью, одним из эффективных путей коррекции микро-элементной недостаточности является использование связанных форм микроэлементов. Иммобилизованные формы характеризуются лучшей биодоступностью, меньшей токсичностью, более высокой эффективностью [9]. Нами разработан способ получения органических форм цинка и йода за счет иммобилизации солей цинка и йода на низкомолекулярных пептидах соевого гидролизата. Исследованы способы химического связывания микроэлементов с функциональными группами носителей; показано наличие ковалентной химической связи для цинка и ионной – для йода. С 1 мг полученного комплекса связывается 0,08 мкг йода и 1,74 мг цинка [10].

Цель исследований . Изучение гормонального статуса организма и морфофункционального состояния структуры щитовидной железы в норме и в условиях йодной недостаточности на модели экспериментального гипотиреоза и коррекции органическими формами йода и цинка.

Задачи: оценить уровень тиреоидных гормонов в сыворотке крови экспериментальных животных; провести морфофункциональный анализ структуры клеток щитовидной железы опытных животных при введении органических форм йода и цинка на фоне экспериментального гипотиреоза.

Материал и методы. Эксперименты проводились на 30 беспородных белых крысах – самцах в возрасте 2 месяцев, массой 150–180 граммов, содержащихся в условиях вивария, в клетках по 2–3 особи, на сбалансированном рационе и при обычном световом режиме. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики (GLP)» и Приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики». Лабораторные животные, используемые в эксперименте, были разделены на три группы с учетом пола, возраста, массы и принципа рандомизации: 1-я – интактные животные – получали воду ad libitum; 2-я – контрольные животные – получали перорально тиреостатик тирозол в дозе 25 мг/кг массы животного в течение 14 дней; 3-я – опытные животные – на фоне экспериментального гипотиреоза, вызванного путем введения тиреостатика тирозола, получали в течение 21 дня органические формы микроэлементов перорально по 0,5 мл раствора с концентрацией йода

1,5 мкг/мл и цинка 75 мкг/мл [10]. Экспериментальную работу проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к Приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986).

Выведение животных из эксперимента осуществляли под эфирным наркозом. В экспериментах по моделированию йодной недостаточности регистрировали уровень тиреотропных гормонов в сыворотке крови экспериментальных животных . Был применен метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора реагентов ООО НПО «Диагностические системы» [11]. Материалы для гистологических исследований помещали в контейнер с 10%-м нейтральным формалином. В течение 24 часов гистологические образцы подвергали промывке в проточной воде с последующей проводкой и заливкой в парафиновые блоки. Гистологические срезы 5-6 мкм для обзорного анализа окрашивали гематоксилином и эозином по Эрлиху.

Морфометрические измерения гистологических срезов заключались в определении диаметра фолликул, высоты эпителия и диаметра ядра тироцитов, которые проводили в 8 полях зрения в каждом препарате. Микрофотографирование исследуемых объектов проводили с использованием микроскопа Axiostar plus, видеокамеры для микроскопа MICROCAM по программе Micrоmed images 1,0 при увеличении в 100, 200 и 400 раз. Корреляционный анализ полученных данных внутри экспериментальных групп проводили по Пирсону.

Полученные цифровые данные подвергали статистической обработке на персональном компьютере с помощью программы «Micromed Excel». Достоверность полученных результатов определяли с помощью критерия Стьюдента (Р < 0,05).

Результаты исследований и их обсуждение. Учитывая патогенетические механизмы развития гипотиреоза, для воспроизведения его основных симптомов была использована модель экспериментального зоба. Для его воспроизведения использовали тиреостатик тирозол в дозе 25 мг/кг массы животного [12].

Из рисунка 1 следует, что введение тирео-статика тирозола вызывало увеличение выработки ТТГ до 0,465±0,0283 мМЕ/л, снижение уровня Т3 до 0,562±0,0316 пг/мл и Т4 до

■ ТТГ

□ Т3

□ Т4

Рис. 1. Изменение уровня тиреоидных гормонов в сыворотке крови животных на фоне экспериментального гипотиреоза и при последующей коррекции органическими формами микроэлементов

Введение разработанной добавки в течение 14 дней восстанавливало изучаемые показатели. Так, уровень ТТГ восстанавливался до 0,176±0,020 мМЕ/л, что составляло 83 % от уровня соответствующего показателя в интактной группе, уровень гормона Т3 – до 4,833±0,250 пг/мл, что в 4 раза превышало показатель в интактной группе животных, а Т4 достигал 10,833±0,450 пг/мл. Превышение уровня гормона Т3 в сыворотке крови животных опытной группы относительно таковых в интактной группе, по-видимому, связано с высоким содержанием йода в добавке, что несомненно требует коррекции.

4,833±0,250 пг/мл, что в 2 раза ниже соответствующих показателей в интактной группе животных

При микроморфологическом исследовании щитовидной железы крыс интактной группы отмечалась органотипическая гистоархитектоника. Междольковые перегородки представлены рыхлой волокнистой соединительной тканью, паренхима железы трабекулами делится на дольки. По этим междольковым прослойкам проходят магистральные сосуды – междольковые артерии и вены. Отчетливо просматривались на паренхиме щитовидной железы компактно расположенные округлые, овальные и часто неправильной формы пузырьки, в основном средней величины с полостью внутри, – фолликулы (рис. 2).

Рис. 2. Интактная группа животных: а – фолликулы; б – эпителиальные клетки на базальной мембране; в – коллоид; г – интерфолликулярные островки; д – тироцит с ядром; е – междольковая перегородка; ж – кровеносные сосуды. Окраска гематоксилином и эозином: 1 – ув. об. 10х10; 2 – ув. об. 40х10

Фолликулы состоят из специализированных железистых эпителиальных клеток, которые лежат на базальной мембране, тироцитов и па-ратироцитов, образующих один слой фолликулярного эпителия. При этом диаметр фолликул колебался от 21,15 до 123,69 мкм и в среднем составил 59,45±7,10 мкм (табл.1). Центральная часть фолликул – полость, содержащая вязкий секрет – коллоид – секреторный продукт тиро-цитов, слаборозового цвета.

Между фолликулами в рыхлой соединительной ткани встречаются эпителиальные клетки, которые образуют интерфолликулярные островки (рис. 2). В большом количестве отмечались тироциты кубической формы. Высота тироцитов колебалась от 10,59 до 18,98 мкм и в среднем составила 15,27±0,69 мкм.

Ядра клеток округло-овальной формы уплощены, цитоплазма оксифильная с мелкой зернистостью. При морфометрическом измерении диаметр ядер тироцитов составлял в среднем 7,15±0,68 мкм (табл.1).

Таблица 1

Средние размеры структуры клеток щитовидной железы в интактной группе животных

Структура щитовидной железы (n=10)	Пределы колебания размеров, мкм M±m	Среднее, мкм M ± m	Коэффициент корреляции по Пирсону
Диаметр фолликулов	21,15–123,69	59,45±7,10	0,44 (связь прямая сильная)
Высота тироцитов	10,59–18,98	15,27±0,69	0,24 (связь прямая средняя)
Диаметр ядер тироцитов	5,17–9,00	7,15±0,68	0,23 (связь прямая средняя)

При гистологическом исследовании щитовидной железы животных в контрольной группе дольчатое строение частично нарушено. Отмечали увеличение размеров долек, их деформацию. В строме железы наблюдались разволокнение и утолщение соединительнотканной основы, отек, который постепенно охватывал всю железу, и увеличение паренхимы щитовидной железы. В щитовидной железе появляется большое число беспорядочно расположенных атрофированных и деформированных мелких и крупных фолликул без четких границ и без содержания коллоида. Соединительнотканные перегородки между дольками не выражены (рис. 3).

Диаметр фолликул варьировал от 72,59 до 177,95 мкм и в среднем составил 117,81±8,95 мкм (табл. 3). В отдельных крупных фолликулах эпителий уплощен и выявлены дистрофические изменения фолликулярного эпителия: набухание клеток и зернистость цитоплазмы. Эпителиальные клетки с нечеткими контурами, в некоторых полях зрения имеют пенистую, светлоокрашенную цитоплазму. Описанные изменения свидетельствуют о начале развития гиперплазии – атрофических и дистрофических процессов в щитовидной железе (рис. 3).

Рис. 3. Контрольная группа животных – отек паренхимы, гиперплазия щитовидной железы: а – фолликулы с пенистой, зернистой цитоплазмой; б – мелкие фолликулы на периферии; в – уплощенный эпителий с вытянутым ядром; г – столбчатый тироцит с вытянутым ядром; д – разволокнение и отек соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином:

1 – ув. об. 20х10; 2 – ув. об. 40х10

Высота тироцитов, имеющих в основном

Ядра эпителиальных клеток вытянутые (рис. 3), столбчатую (цилиндрическую) форму, колеба-  размеры составили в среднем 8,54±0,60 мкм лась от 12,98 до 22,62 мкм, в среднем (табл. 2).

18,72±0,90 микрометра.

Таблица 2

Средние размеры структуры клеток щитовидной железы в контрольной группе животных

Структура щитовидной железы (n=10)	Пределы колебания размеров, мкм M±m	Среднее, мкм M ± m	Коэффициент корреляции по Пирсону
Диаметр фолликулов	72,59-177,95	117,81±8,95*	0,28 (связь прямая средняя)
Высота тироцитов	12,98-22,62	18,72±0,90*	0,16 (связь прямая слабая)
Диаметр ядер тироцитов	6,64-10,76	8,54±0,60*	0,19 (связь прямая средняя)

* Достигнутый уровень значимости относительно интактной группы (1) Р<0,05.

После введения перорально органических форм микроэлементов при микроскопическом исследовании срезов щитовидной железы опытных групп наблюдали более четкие перегородки, разделяющие железу на дольки, и компактно расположенные фолликулы на паренхиме щитовидной железы в отличие от контрольной группы. Отмечали существенное уменьшение размеров долек, уменьшение отека и появление в паренхиме мелких и средних фолликул в отличие от контрольной группы животных (рис. 4).

Просвет фолликул заполнен коллоидом слабо-розового цвета. При этом диаметр фолликул варьировал от 39,83 до 83,08 мкм и в среднем составлял 60,96±4,89 микрометра.

Отмечали уменьшение островков из парафолликулярных клеток и увеличение количества тироцитов неправильной формы. Интерфолликулярные клетки в единичных случаях имели светлоокрашенную паренхиму (рис. 4). Высота тироцитов колебалась от 11,82 до 21,94 мкм, средняя величина составила 15,88±1,56 микрометра (табл. 3).

Рис. 4. Опытная группа животных – восстановительные процессы щитовидной железы крыс: а – фолликулы; б – коллоид; в – интерфолликулярные островки; г – эпителиальные клетки на базальной мембране; д – тироцит с овальным ядром; ж – междольковая перегородка. Окраска гематоксилином и эозином: 1 – ув. об. 20х10; 2 – ув. об. 40х10

Описанные изменения свидетельствуют о начале развития восстановительных процессов в щитовидной железе.

На базальной мембране фолликул наблюдали эпителиальные клетки с ядрами, расположенные в один слой и образующие фолликулярный эпителий. Ядра эпителиальных клеток округлые, овальные (рис. 4), размеры колеба- нем 7,07±1,05 микрометра (табл. 3).

лись от 3,91 до 10,06 мкм и составляли в сред-

Таблица 3

Средние размеры структуры клеток щитовидной железы в опытной группе животных

Структура щитовидной железы (n=10)	Пределы колебания размеров, мкм M±m	Среднее, мкм M ± m	Коэффициент корреляции по Пирсону
Диаметр фолликул	39,83-83,08	60,96±4,89**	0,24 (связь прямая средняя)
Высота тироцитов	11,82-21,94	15,88±1,56**	0,23 (связь прямая средняя)
Диаметр ядер тироцитов	3,91-10,06	7,07±1,05**	0,36 (связь прямая сильная)

** Достигнутый уровень значимости относительно контрольной группы Р<0,05.

Таким образом, у здоровых крыс интактной группы фолликулы имели преимущественно округлую или овальную форму и были компактно распределены по всей паренхиме железы, средний диаметр фолликул составил 59,45±7,10 мкм (р<0,001). Стенка базальной мембраны фолликула выстлана о днослойным э пителием, состоящим из тироцитов. Полость фолликула заполнена продуктом секреции ти-роцитов – коллоидом. В зависимости от функционального состояния железы высота эпителия, форма и размеры фолликул изменялись. Так, в интактной группе тироциты щитовидной железы имели форму куба, а процессы образования и резорбции коллоида уравновешены, средняя высота тироцитов составила 15,27±0,69 мкм (р<0,05). Ядра тироцитов округло-овальной формы и при измерении составляли в среднем 7,15±0,69 мкм (Р<0,01).

При экспериментальном гипотиреозе в щитовидной железе развивались выраженные гистологические изменения, приводящие к морфологической перестройке структуры железы. Морфологическая перестройка структуры железы происходила постепенно, как в строме, так и в паренхиме железы.

При гипофункции щитовидной железы эпителий уплощался, фолликулы увеличивались в размерах и составляли в среднем 117,81±8,95 мкм (р<0,01). Тироциты становились столбчатыми (цилиндрическими), высота эпителиальных кле- ток составила 18,72±0,90 мкм (р<0,05), объем фолликул уменьшался за счет резорбции коллоида. Ядра эпителиальных клеток вытянутые и размеры составляли в среднем 8,54±0,60 мкм (Р<0,01).

Увеличение высоты тиреоидного эпителия и изменение ядер по форме и по размерам относительно интактной группы на фоне экспериментального гипотиреоза свидетельствовало о снижении функциональной активности щитовидной железы. При этом уровень гормона Т3 снизился в 1,19 раза, уровень гормона Т4 – в 1,46 раза, что и вызвало увеличение гормона ТТГ в 1,47 раза и указывало на возникновение гипотиреоза у экспериментальных животных [13].

Так, в работах ряда авторов отмечалось, что при экспериментальном гипотиреозе, вызванном тиреостатиком «Тирозол», гистоархитектоника щитовидной железы крыс характеризовалась гетероморфностью. Форма фолликул варьировала от округло-овальной до звездчатой (90,9±3,96 мкм).

Тироциты (17,4±1,19) центральных фолликул имели ядра округлой формы с участком просветления, содержащие одно, реже два ядрышка (12,2±0,59 мкм). В фолликулах звездчатой формы морфология тироцитов отмечалась вариативностью (от высокопризматических до уплощенных) [14, с.179].

Подобные описания отмечались в работах В.В. Токарь [6], И.В. Смеловой и Е.С. Гончаровой [15]. Аналогичные результаты получены в работах Р.Р. Максютова и др. [16].

Коррекцию йоддефицитного состояния проводили с помощью органических форм йода и цинка, полученных иммобилизацией на низкомолекулярные пептиды соевого гидролизата. По окончании эксперимента в опытных группах животных после перорального введения органических форм йода и цинка на фоне экспериментального гипотиреоза отмечали восстановление диаметра фолликул до 60,96±4,89 мкм (р<0,01), высоты эпителия до 15,88±1,56 мкм (р<0,01) и диаметра ядер до 7,07±1,05 мкм , что характерно для соответствующих показателей щитовидной железы животных в интактной группе.

Морфологические изменения, наблюдаемые нами в опытной группе животных, характеризовались как генеративные процессы, направленные на восстановление гистоархитектоники щитовидной железы после повреждающего действия тиреостатика тирозола.

Выводы

• 1.    Введение органической формы йода и цинка на фоне экспериментальной йодной недостаточности стимулировало синтез гормонов щитовидной железы и ингибировало выработку тиреотропного гормона.

• 2.    Введение тиреостатика тирозола экспериментальным животным вызвало увеличение диаметра фолликул, высоты тиреоидного эпителия и изменение ядер клеток по форме и по размерам в контрольной группе крыс относительно таковых интактной группы. Данные морфометрических измерений указывают на снижение функциональной активности щитовидной железы.

• 3.    У животных опытной группы, получавших органические формы йода и цинка на фоне экспериментального гипотиреоза, наблюдалось восстановление функциональной активности щитовидной железы, что подтверждается появлением коллоида в фолликулах. Микроморфо-логическая картина и морфометрические пока-

• затели клеток – восстановление диаметра фолликул, высоты эпителия и диаметра ядер клеток по форме и по размерам – свидетельствовали о восстановительных процессах в гистоархитектонике щитовидной железы.