Влияние органических солей лития на содержание белков Akt/mTOR-сигнального пути в мононуклеарах периферической крови больных биполярным аффективным расстройством

В настоящее время существует большое количество лекарственных средств, используемых для психофармакотерапии аффективных расстройств. Новый взгляд на химическую структуру классических препаратов является перспективным направлением в отношении обнаружения их новых терапевтических свойств, помимо собственно психотропного действия. Нормотимик литий ис- пользуется в клинической психофармакологии вот уже более 70 лет [1], однако его применение ограничено в связи с низкой терапевтической широтой действия и высокой частотой развития побочных эффектов [2]. В настоящее время литий, в частности его карбонатная соль, широко применяется в психиатрической практике для лечения и профилактики биполярного аффективного расстройства (БАР) [3].

Карбонат лития ‒ наиболее часто используемая в клинической психофармакологии химическая форма лития. В этом случае карбонат-анион (CO 3 ^2-) является биологически пассивным лигандом. Мы предполагаем, что новый класс соединений, образованных в результате замещения CO 3 ^2-анионными остатками кислот-клеточных метаболитов, участвующих в энергетическом обмене, будет обладать комбинированным нормотимическим и цитопротекторным эффектами. В соответствии с выдвинутой гипотезой были выбраны следующие кислоты: фумаровая, янтарная (субстраты цикла Кребса) и пировиноградная (предшественник ацетилкофермента А (ацетил-КоА), ключевого клеточного метаболита, участвующего в катаболических и анаболических реакциях). Ранее нами продемонстрированы антиоксидантный [4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11], иммуностимулирующий [12] и цитопротекторный [9, 13, 14] эффекты данных солей.

Важным является понимание молекулярных механизмов реализации биологических эффектов предложенных нами органических солей лития. Интересным в этом отношении представляются белки Akt/mTOR-сигнального пути. Данный путь является общим для всех клеток организма и представляет собой комплекс внутриклеточных белков, в основном протеинкиназ, для которых характерна каскадная активация. Следующие вне-и внутриклеточные регуляторные стимулы приводят к инициации Akt/mTOR-сигнального пути: факторы роста (инсулин, IGF, GDNF, нейротро-фины, цитокины), нутриенты, такие как аминокислоты и различные стрессорные факторы (гипоксия, снижение энергопродукции) [15]. Белки данного пути регулируют следующие универсальные клеточные процессы: синтез белка, аутофагия, углеводный обмен, дифференцировка клеток, клеточный цикл, пролиферация, апоптоз [16].

На сегодняшнее время Akt/mTOR-сигнальный путь рассматривается как перспективная мишень для психотропных препаратов, что обусловлено рядов факторов. Белки данного пути играют важную роль в физиологии нервной ткани: пролиферация и дифференцировка нейральных стволовых клеток (NSCs), миелинизация, рост и формирование аксонов и дендритов, синаптогенез, а также проведение сигнала от нейромедиаторов [17]. Также считается, что Akt/mTOR-сигнальный путь играет роль в патогенезе шизофрении, депрессии и БАР, что подтверждено в ряде исследований животных моделей и биоматериала пациентов [18, 19].

В связи с вышеперечисленным актуальным аспектом нам представляется оценка вовлеченности органических солей лития в работу Akt/mTOR-сигнального пути.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка влияния карбоната, фумарата, пирувата и сукцината лития на содержание белков Akt/mTOR-сигнального пути в мононуклеарах периферической крови больных биполярным аффективным расстройством.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследуемую группу вошли 12 пациентов с БАР, проходивших лечение в клинике НИИ психического здоровья Томского НИМЦ РАН, из них 7 женщин и 5 мужчин; медиана возраста: 48,0 года (37,5-52,0). Пациенты имели следующие диагнозы по МКБ-10: 1 человек с эпизодом мании без психотических симптомов (F31.1), 5 ‒ с эпизодом легкой или умеренной депрессии (F31.3), 1 ‒ с эпизодом тяжелой депрессии без психотических симптомов (F31.4), 1 ‒ с эпизодом тяжелой депрессии с психотическими симптомами (F31.5), 4 ‒ с эпизодом смешанного характера (F31.6). Пациенты, принимавшие литий в качестве поддерживающей терапии на момент поступления в стационар, были исключены из исследования. Все участники дали письменное информированное согласие после надлежащего объяснения предполагаемого исследования.

Получение клеточной культуры мононукле-аров крови

Клетки получали из цельной венозной крови, взятой в одноразовые пробирки «Vacutainer» (Becton Dickinson, США) с гепарином натрия в качестве антикоагулянта. Взятие крови производилось в момент поступления пациента в стационар из локтевой вены утром натощак. Выделение мононуклеаров осуществлялось методом центрифугирования на градиенте плотности фи-колла (ρ=1,077 г/см3; Sigma-Aldrich, Германия). Полученные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 2 ммоль/л L-глутамина (Gibco, США), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 25 ммоль/л HEPES (Sigma-Aldrich, Германия) и 50 мкг/мл гентамицина (Sigma-Aldrich, Германия). После приготовления суспензию клеток сразу использовали в эксперименте.

Экспериментальные условия

Для оценки влияния карбоната, фумарата, пирувата и сукцината лития на уровни белков Akt/mTOR-сигнального пути клетки инкубировали с данными соединениями в течение 24 часов при 37°C и 5% СО 2 . Концентрация солей в культуральной среде, основанная на конечной концентрации ионов лития, составляла 1,2 ммоль/л. Изучаемые соединения были синтезированы на базе Исследовательской школы химических и биомедицинских технологий Томского политехнического университета. Их химическая структура представлена на рисунке 1.

Карбонат лития

Фумарат лития

Сукцинат лития

Пируват лития

Р и с у н о к 1. Химическая структура исследуемых соединений лития

Оценка внутриклеточного содержания белков Akt/mTOR-сигнального пути

Определение исследуемых 11 белков Akt/mTOR-сигнального пути и их фосфорилированных форм производилось по технологии (Lu-minex, США), ЦКП «Медицинская геномика» Томского НИМЦ). Для оценки уровня общих форм белков использовался набор «MILLIPLEX MAP

Total Akt/mTOR Magnetic Bead 11-Plex Kit» (Merck, Германия). Для оценки уровня фосфоформ ‒ набор «MILLIPLEX MAP Phosphoprotein Akt/mTOR Magnetic Bead 11-Plex Kit» (Merck, Германия). Для нормализации результатов определялось содержание глицеральдегидфосфатдегид-рогеназы (GAPDH). Список исследуемых белков и их функция представлены в таблице 1.

Т а б л и ц а 1. Исследованные белки и их функции (из Yu J.S. et al., 2016)

Белок	Положение фосфата	Функция
IR (insulin receptor, инсулиновый рецептор)	Тирозин-1162/1163	Взаимодействие с инсулином, активация сигнального белка фосфотадил-инозитол-3-фосфаткиназы (PI3K)
IGF1R (insulin-like growth factor 1, IGF-1 receptor, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1)	Тирозин-1135/1136	Взаимодействие с IGF-1, активация PI3K
Протеинкиназа Akt (RAC-alpha, серинтреониновая протеинкиназа)	Серин-473	Сигналинг. Регуляция активности GSK-3, TSC2, транскрипционных факторов
mTOR (mammalian target of rapamycin, мишень рапамицина млекопитающих)	Серин-2448	Сигналинг. Образование белковых комплексов, активирующих Akt, RPS6, транскрипционные факторы
PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10, гомолог фосфатазы и тензина, делецированный на хромосоме 10)	Серин-380	Непрямое ингибирование Akt и mTOR через расщепление инозитол-3-фосфата
IRS1 (insulin receptor substrate 1, субстрат инсулинового рецептора 1)	Серин-312	Проведение сигнала от IR, активация PI3K
GSK-3α/β (glycogen synthase kinase 3 alpha/beta, киназа гликогенсинтазы 3 альфа/бета)	Серин-21/серин-9	Регуляция активности (преимущественно негативная) около 100 белков-субстратов
p70S6K (ribosomal protein S6 kinase beta-1, рибосомальная протеинкиназа S6 β-1),	Треонин-412	Активация синтеза белка через фосфорилирование RPS6
RPS6 (ribosomal protein S6, рибосомальный белок S6)	Серин-235/236	Регуляция трансляции на 40S субъединицы рибосомы
TSC2 (tuberouss clerosis complex 2 (tuberin), комплекс туберозного склероза 2 (туберин)	Серин-939	Ограничение роста клеток за счет активации процессов лизосомальной, протеосомальной деградации и убиквинтинизации

Для каждого белка в пробе вычислялся показатель средней интенсивности флюоресценции (mean fluorescence intensity, MFI). Уровень общей формы конкретного белка и уровень фосфо-формы конкретного белка вычислялись как:

MFI общей формы /MFI GAPD .

MFI фосфо-формы /MFI общей форм

Статистическая обработка результатов проведена с помощью программы SPSS (v. 20.0). Рассчитывали медиану, первый и третий квартили. Для сравнения количественных переменных использовались критерии Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Инкубация мононуклеаров больных БАР с карбонатом, фумаратом или сукцинатом лития не привела к статистически значимым изменениям в содержании общих форм исследуемых белов Akt/mTOR-сигнального пути по сравнению с контрольной культурой. Обнаружено, что пируват лития статистически значимо повышал уровень 10 белков по сравнению с интактными клетками (р<0,05) (табл. 2). По результатам эксперимента, инкубация клеток с солями лития приводила к следующим изменениям содержания фосфоформ белков: карбонат, сукцинат и фумарат лития не оказывали статистически значимого влияния по сравнению с интактной культурой.

Т а б л и ц а 2. Содержание [Мe (Q1-Q3)] общих форм белков Akt/mTOR-сигнального пути в мононуклеарах периферической крови больных биполярным аффективным расстройством инкубации с солями лития (критерий Манна-Уитни)

Белок	Интактные клетки	Карбонат лития	Фумарат лития	Пируват лития	Сукцинат лития
GSK-3β	0,19 (0,16-0,31)	0,31 (0,22-0,42) p=0,083	0,33 (0,21-0,57) p=0,050	0,70* (0,48-1,0) p<0,001	0,28 (0,23-0,29) p=0,272
IGF1R	0,07 (0,06-0,13)	0,10 (0,04-0,4) p=0,729	0,04 (0,03-0,13) p=0,356	0,10* (0,04-0,13) p=0,002	0,10 (0,04-0,13) p=0,673
IRS1	0,06 (0,04-0,08)	0,06 (0,05-0,11) p=0,564	0,06 (0,05-0,11) p=0,419	0,17* (0,15-0,30) p=0,003	0,04 (0,04-0,06) p=0,310
Akt	0,07 (0,04-0,10)	0,12 (0,09-0,18) p=0,065	0,16 (0,07-0,25) p=0,057	0,42* (0,17-0,73) p=0,001	0,11 (0,07-0,17) p=0,151
mTOR	0,03 (0,03– 0,04)	0,04 (0,03-0,05) p=0,133	0,05 (0,03-0,06) p=0,065	0,09* (0,07-0,10) p<0,001	0,04 (0,03-0,04) p=0,499
p70S6K	0,40 (0,26-0,74)	0,50 (0,31-0,70) p=0,603	0,64 (0,37-0,73) p=0,488	0,95* (0,66-1,74) p=0,014	0,49 (0,34-0,68) p=0,800
IR	0,04 (0,03-0,05)	0,05 (0,04-0,05) p=0,184	0,05 (0,04-0,07) p=0,356	0,09* (0,08-0,11) p<0,001	0,04 (0,03-0,05) p=0,800
PTEN	1,20, (1,01-2,13)	1,47 (1,08-2,07) p=0,564	1,60 (1,18-2,41) p=0,106	2,99* (1,60-4,71) p=0,003	1,33 (1,09-1,74) p=0,735
GSK-3α	0,41 (0,33-0,79)	0,48 (0,76-0,83) p=0,184	0,74 (0,44-1,25) p=0,106	1,68* (1,0-2,70) p<0,001	0,53 (0,51-0,68) p=0,310
TSC2	0,29 (0,18-0,57)	0,37 (0,22-0,50) p=0,488	0,35 (0,21-0,69) p=0,386	0,95* (0,36-1,49) p=0,031	0,31 (0,27-0,35) p=0,612
RPS6	0,05 (0,04-0,08)	0,06 (0,04-0,09) p=0,488	0,06 (0,03-0,07) p=0,954	0,07 (0,06-0,07) p=0,268	0,06 (0,04-0,07) p=0,673

П р и м е ч а н и е. p ‒ Уровень значимости по сравнению с интактными клетками: * ‒ p<0,05.

Т а б л и ц а 3. Содержание [Мe (Q 1 -Q 3 )] фосфорилированных форм белков Akt/mTOR-сигнального пути в мононуклеарах периферической крови больных биполярным аффективным расстройством инкубации с солями лития (критерий Манна-Уитни)

Фосфо-форма	Интактные клетки	Карбонат лития	Фумарат лития	Пируват лития	Сукцинат лития
Фосфо-сер-9-GSK-3β	0,15 (0,10-0,17)	0,12 (0,13-0,23) p>0,999	0,15 (0,08-0,19) p=0,734	0,071* (0,05-0,13) p<0,001	0,10 (0,06-0,13) p=0,152
Фосфо-тир-1135/1136-IGF1R	0,07 (0,05-0,05)	0,03 (0,02-0,07) p=0,678	0,04 (0,01-0,05) p=0,734	0,04 (0,03-0,05) p=0,002	0,05 (0,03-0,07) p=0,336
Фосфо-сер-312-IRS1	0,07 (0,05-0,09)	0,10 (0,05-0,19) p=0,384	0,10 (0,04-0,17) p=0,734	0,06 (0,04-0,11) p=0,003	0,15 (0,14-0,22) p=0,094
Фосфо-сер-473-Akt	0,61 (0,25-1,32)	0,20 (0,10-0,40) p=0,122	0,18 (0,13-0,43) p=0,115	0,08* (0,05-0,19) p=0,001	0,41 (0,33-0,61) p=0,955
Фосфо-сер-2448-mTOR	9,81 (5,54-13,15)	3,64, (2,60-27,67) p=0,408	4,84, (2,69-7,23) p=0,088	1,67*, (1,24-2,36) p <0,001	4,39, (1,86-6,48) p=0,097
Фосфо-тир-1162/1163-IR	0,36 (0,33-0,66)	0,85 (0,24-1,48) p=0,606	0,64 (0,36-1,67) p=0,285	0,43 (0,24-0,59) p<0,001	0,72 (0,57-0,96) p=0,38
Фосфо-сер-380-PTEN	0,47 (0,27-0,49)	0,45 (0,31-0,56) p=0,970	0,34 (0,22-0,63) p=0,734	0,30 (0,10-0,32) p=0,003	0,34 (0,21-0,42) p=0,397
Фосфо-сер-21- GSK-3α	0,09 (0,04-0,12)	0,09 (0,06-0,12) p=0,910	0,07 (0,05-0,11) p=0,851	0,03 (0,02-0,07) p<0,001	0,04 (0,03-0,07) p=0,281
Фосфо-сер-939-TSC2	0,18 (0,16-0,20)	0,21 (0,07-0,35) p=0,488	0,11 (0,04-0,30) p=0,492	0,14 (0,04-0,36) p=0,031	0,17 (0,11-0,25) p=0,613
Фосфо-сер-235/236-RPS6	0,20 (0,15-0,58)	0,44 (0,16-0,91) p=0,488	0,55 (0,22-1,16) p=0,135	0,75* (0,43-1,02) p=0,010	0,39 (0,30-0,39) p=0,876

П р и м е ч а н и е. p ‒ Уровень значимости по сравнению с интактными клетками: * ‒ p<0,01.

Как показано в таблице 3, инкубация с пируватом лития привела к значительному изменению концентрации фосфо-форм 4 белков по сравнению с контрольными значениями: GSK-3β: 0,067 (0,053-0,13) и 0,16 (0,10-0,17) соответственно (p=0,009); Akt: 0,084 (0,053-0,19) и 0,61 (0,25-1,32) соответственно (p=0,009); mTOR: 1,67 (1,24-2,36) и 9,81 (5,54-13,15) соответственно (p=0,014); RPS6: 0,76 (0,43-1,02) и 0,20 (0,15-0,58) соответ-ственно(=0,010).

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, в результате исследования было обнаружено, что пируват лития повышал содержание 10 общих форм белков Akt/mTOR-сигнального пути, но при этом одновременно уменьшая содержание фосфо-форм Akt, GSK-3β и mTOR в мононуклеарах больных БАР. Инкубация клеток с данной солью также приводила к увеличению уровня фосфо-формы RPS6. Однако в соответствии с полученными данными нельзя сделать однозначного заключения о направленности влияния пирувата лития на активность Akt/mTOR-сигнального пути. С одной стороны, наблюдается снижение активных фосфо-форм ключевых сигнальных белков данного пути (Akt и mTOR), обеспечивающих взаимосвязь мембранных рецепторов клетки (в нашем исследовании – IR и IGF1R) c регуляторными (GSK-3α и β) и «эффекторными» белками (p70S6K, RPS6, TSC2), непосредственно действующими на клеточные процессы. С другой стороны, при действии пирувата в течение 24 часов в мононукле-арах регистрируется повышении уровня 10 из 11 общих форм исследуемых белков.

По итоговым результатам карбонат, фумарат и сукцинат лития не оказывали статистически значимого влияния на содержание общих и фосфоформ изучаемых белков Akt/mTOR-сигнального пути. Можно сделать вывод, что в данной экспериментальной модели как ионы лития, так и кислотные остатки фумаровой и янтарной кислот не имеют собственного эффекта.

Таким образом, единственным биоактивным лигандом в нашем исследовании является остаток пировиноградной кислоты – пируват. Данное соединение является ключевым клеточным метаболитом, образующимся из глюкозы в ходе гликолиза, а затем в присутствии пируватдегидрогеназы преобразующимся в ацетил-КоА. Т.е. ацетил-КоА служит субстратом для цитрата – первого компонента цикла Кребса, который необходим для производства АТФ в митохондриях. Вместе с тем ацетил-КоА участвует в синтезе жирных кислот и холестерина, а также в ацетилировании белков [20]. Повышение содержания изученных нами белков при действии пирувата на клетки может быть объяснено связью процессов энерго- обмена и активностью Akt/mTOR-сигнального пути. Известно, что белки данного пути, в частности Akt и GSK-3, регулируют углеводный обмен, а снижение активности Akt и, как следствие, активация GSK-3 приводит к подавлению синтеза гликогена и транспорта глюкозы в клетку [21]. Дополнительная стимуляция пируватом процессов цикла Кребса и, как следствие, конечное аэробное расщепление глюкозы с образованием АТФ по принципу отрицательной обратной связи может снижать активность Akt и mTOR, а также повышать активность GSK-3 через её дефосфорилирование [22]. Данный процесс может служить объяснением обнаруженного нами пониженного содержания фосфо-форм данных белков в клетках после инкубации с пируватом лития. Повышение 10 общих форм белков может быть следствием индукции экспрессии их генов. Как видно из таблицы 1, часть из них вовлечена в белковый обмен: RPS6, p70S6K, TSC2. Вероятно, что повышение продукции АТФ в результате увеличения концентрации пирувата способно инициировать клетку для анаболических процессов через Akt/mTOR-сигнальный путь. Подобная индукция активности, в частности mTOR, субстратами белкового синтеза показана в ряде исследований [22, 23].

Ранее нами описан цитопротекторный эффект пирувата лития в отношении мононуклеаров периферической крови лиц группы контроля, больных алкогольной зависимостью [9] и пациентов с депрессивными расстройствами и БАР (неопубликованные данные). Способность данного соединения влиять на Akt/mTOR-сигнальный путь, обнаруженная в данном исследовании, может быть одним из механизмов этого эффекта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют о влиянии пирувата лития на активность Akt/mTOR-сигнального пути в мононуклеарах больных БАР. Результаты исследования помогут расширить представление о потенциальных молекулярных механизмах действия соединений лития на основе органических кислот-метаболитов клеточного энергообмена, а также определить перспективу для дальнейшего их изучения в качестве новых потенциальных нормотимиков комбинированного действия.