Влияние остаточного количества антибактериального препарата в перепелиных эмбрионах на морфофункциональные характеристики клеточного монослоя как субстрата для культивирования вирусов

EDN:

Москва, Российская Федерация,

В промышленном перепеловодстве применение антибактериальных препаратов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний птиц является широко распространенной практикой, обусловленной высокой плотностью посадки (до 80 голов/м²)¹, интенсивностью обмена веществ и чувствительностью перепелов к бактериальным агентам, таким как Escherichia coli, Salmonella spp., Mycoplasma spp. и Pasteurella spp. [1]. Среди используемых средств выделяются фторхинолоны, в частности ципрофлоксацин (в препаратах типа Ципровет 10 %), обладающий широким спектром антимикробного действия и высокой биодоступностью (70-80 % всасывание из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), проникновение в ткани до 0,58 мкг/г через 24–48 ч после введения) [2]. Ципрофлоксацин эффективно подавляет ДНК-гиразу бактерий, вызывая лизис, однако его неспецифическое воздействие на митохондрии эукариотических клеток проявляется в токсичности: связывание с белками AIFM1 и IDH2, ингибирование комплексов I и IV дыхательной цепи (ETC), накопление реактивных форм кислорода (ROS), липидная пероксидация, оксидативный стресс и активация апоптоза. Это приводит к морфологическим изменениям клеток (деформация, рыхлость монослоя, потеря эпителиальной формы, непрозрачная кариоплазма, снижение адгезии и пролиферации), как показано в культурах CHO-K1 и биопленках Enterococcus faecium [3; 4]. Хроническое воздействие сублетальных остатков усугубляет эффекты, вызывая стеатоз печени, атрофию почечных клубочков, иммуносупрессию у мышей [5]. Несмотря на регламентированные периоды выведения, остаточное количество антибиотика накапливается в яйцах, поступая в развивающийся организм и создавая риски для биотехнологических процессов. Биологические эффекты таких сублетальных доз на эмбриональные клетки остаются недостаточно изученными, что создает потенциальные риски при производстве вирусных вакцин.

В настоящее время в производстве вирусных вакцин для медицинского применения большое внимание уделяется стандартизации технологических процессов, валидации оборудования и контролю культуральных сред. Однако качество исходного биологического сырья – в частности клеточных культур, получаемых из перепелиных эмбрионов, – остается фактором, влияние которого требует углубленного изучения. Клеточные культуры, получаемые из эмбрионов перепелов, служат критически важным и широко используемым субстратом для культивирования вирусов при изготовлении вакцин благодаря высокой чувствительности, быстрому формированию монослоя и устойчивости к контаминации, но их адгезивная способность, пролиферативная активность, плотность и устойчивость к вирусной инфекции напрямую определяют титр вируса (≥ 5,95 lg ТЦД50 /0,5 мл), антигенные свойства и безопасность вакцины2,3. Любое отклонение может привести к падению продуктивности, выбраковке серий и экономическим потерям, усугубляя дефицит иммунобиологических препаратов и риск антибиотикорезистентности.

Несмотря на наличие исследований, изучающих токсичность фторхинолонов [6–9], системные наблюдения причинно-следственной связи между нагрузкой антибактериальным препаратом родительского стада и качеством монослоя из эмбрионов отсутствуют, особенно для перепелов, где данных по сравнению с куриными культурами меньше. Проведение таких исследований внесет вклад в клеточную биологию, вирусологию и стандарты безопасности вакцин.

Цель работы – обоснование критериев отбора биологического сырья для повышения безопасности и эффективности производства вирусных вакцин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведен сравнительный анализ морфофункциональных характеристик монослоев, полученных методом трипсинизации. Перепелиные эмбрионы получены от птиц, прошедших терапию препаратом Ципровет 10 % с действующим веществом ципрофлоксацин, у которых в яйцах сохранялось остаточное количество антибактериального препарата, а также от птиц, яйца которых не содержали ципрофлоксацин.

Пролечивание родительского стада

Характеристика стада:

• -    Порода перепелов: линия C99R;

• -    Возраст птиц: 6 месяцев;

• -    Количество птиц в стаде: 50 голов (25 самцов и 25 самок);

• -    Условия содержания: клеточные, в специализированных чистых помещениях с контролируемыми параметрами микроклимата. Для обеспечения микробиологической безопасности используется подготовленная вода, подвергаемая ультрафиолетовой обработке, и автоклавируемый корм.

Родительское стадо было пролечено препаратом Ципровет 10 % (ООО «НВЦ Агровет-защита», Россия) с действующим веществом ципрофлоксацин. Он используется для лечения птиц при колибактериозе, сальмонеллезе, хронических респираторных заболеваниях, стрептококкозе, некротическом энтерите, ге-мофилезе, микоплазмозе, смешанных и вторичных инфекциях при вирусных болезнях.

Препарат выпаивали с водой в суточной дозе 0,5 мл на 1 л питьевой воды в течение 5 дней. После пролечивания стада яйца передавались на контроль остаточного количества ципрофлоксацина методом иммуноферментного анализа4. Результаты представлены в таблице 1.

В качестве опытной группы брались яйца на 13-й день после пролечивания, с остаточным количеством антибактериального препарата в яйце 0,0015 мг/кг. Для контрольной группы использовались яйца на 31-й день после про-лечивания без присутствия остаточного количества ципрофлоксацина в яйце.

Трипсинизация

Вскрытие перепелиных яиц и извлечение эмбрионов происходило в чистых помещениях класса В в ламинарной зоне класса А. В процессе вскрытия и извлечения эмбрионов проводилась визуальная оценка тушек на наличие уродств, среди которых помутнение слизистой оболочки глаза (белые глаза), кровоизлияния, альбинизм, а также отсутствие глаз. После вскрытия яиц и извлечения эмбрионов формировались порции по 50–52 тушки в каждой (вес каждого эмбриона варьируется от 39,5 до 40,5 г). Затем происходил этап отмывания эмбриональной ткани раствором, содержащим фосфатный буферный раствор и раствор глюкозы. Процесс повторялся трижды. После отмывания порции передавались на этап претрипсинизации, на котором каждую порцию заливали раствором диспергента, содержащим также фосфатный буферный и раствор глюкозы с добавлением трипсина. Претрипсинизация проходила в течение 30 мин при температуре 37 °С. Затем порции промывались раствором диспергента до просветления жидкости. Для окончательной трипсинизации порции заливались раствором диспергента и устанавливались на магнитные мешалки. По истечении 2 ч полученная клеточная взвесь фильтровалась и передавалась на этап заражения [10].

Заражение

Этап заражения проводился в чистых помещениях класса В с ламинарной зоной класса А. Полученная отфильтрованная клеточная взвесь добавлялась в бутыль с питательной средой и тщательно перемешивалась.

Т а б л и ц а 1. Результаты контроля содержания остаточного количества ципрофлоксацина в яйце

T a b l e 1. Results of residual ciprofloxacin concentration monitoring in egg

День после окончания курса / Day after completion of treatment	Остаточное количество ципрофлоксацина, мг/кг / Residual ciprofloxacin concentration, mg/kg
0 6 13 20 31	0,1895 0,0440 0,0015 Отсутствует / Not detected Отсутствует / Not detected

Источник: здесь и далее таблицы составлены авторами.

Source: from here and below tables are compiled by the authors.

Затем 350 мл смеси отливалось в роллерную бутыль (далее - роллер). Так получился контрольный роллер без вируса паротита для отслеживания изменений монослоя. Далее в бутыль с клеточной взвесью и питательной средой вносился производственный штамм вируса паротита и тщательно перемешивался. Полученная взвесь разливалась в роллеры по 350 мл, а затем зараженные роллеры вместе с контрольным помещались в роллерный инкубатор при температуре 35,5 °С при непрерывном вращении роллерных бутылей.

Световая микроскопия

Полученный монослой просматривался при помощи светового микроскопа. Оценивалась плотность, ровность и целостность монослоя, а также положение клеток относительно друг друга, их форма и наличие дегенеративных изменений.

Определение специфической активности вируса паротита

Данная процедура проводилась методом титрования⁵. Титр вируса определялся по цитопатическому действию (ЦПД) вируса на культуре клеток Vero . Каждый образец индивидуального вирусного сбора (ИВС) должен иметь специфическую активность не ниже 5,95 lg ТЦД 50 /0,5 мл, в противном случае ИВС не может быть передан на дальнейший этап производства вирусной вакцины.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При вскрытии яиц установлено, что эмбрионов с уродствами в опытной группе значительно больше, чем в контрольной. Количество перепелиных эмбрионов с помутнением слизистой оболочки глаз составило 26 % от всех вскрытых яиц опытной группы, в то время как у контрольной группы – только 7 % от всех вскрытых яиц. Повышение количества эмбрионов с уродствами увеличивает отход и, соответственно, повышает затраты на производство.

На рис. 1-2 представлены фотографии световой микроскопии монослоев, полученных от контрольной и опытной групп.

После проведения визуального контроля и сравнения двух монослоев с помощью световой микроскопии можно сделать выводы, представленные в таблице 2.

На основе полученных данных можно заключить, что остаточное количество антибактериального препарата влияет на морфологические признаки монослоя как субстрата для культивирования вируса паротита при производстве паротитной вакцины. Под влиянием остаточного количества антибактериального препарата клеточная стенка истончается, что приводит к тому, что трипсин начинает действовать раньше. Вследствие этого наблюдается большое количество мертвых клеток, плавающих в питательной среде роллеров опытной группы.

5 ФС.3.3.1.0036.15 Вакцина паротитная культуральная живая [электронный ресурс].

Р и с. 1. Монослой в контрольном роллере: a) без антибактериального препарата, контрольная группа, b) полученный из яиц, содержащих остаточное количество антибактериального препарата, опытная группа F i g. 1. Monolayer in a control roller bottle: a) free from antibacterial agent, control group, b) derived from eggs containing residual antibacterial agent, experimental group

Источник: здесь и далее фотографии получены с использованием светового микроскопа HIMERA HII 53.

Source: hereinafter, the images were obtained using a HIMERA HII 53 light microscope.

Р и с. 2. Монослой, зараженный вирусом паротита: а) контрольная группа, b) опытная группа F i g. 2. Monolayer infected with the mumps virus: а) control group, b) experimental group

Т а б л и ц а 2. Сравнение монослоев

T a b l e 2. Comparison of monolayers

Монослой, полученный из эмбрионов контрольной группы /

Monolayer derived from embryos of the control group

На контрольном роллере видно плотное, равномерное клеточное покрытие. Клетки расположены плотно, однородно с минимальным количеством проплешин и отходов. Монослой выглядит структурированным и организованным / The control roller bottle exhibits a dense, uniform cellular coverage. Cells are densely and homogeneously arranged, with minimal gaps or cellular debris. The monolayer appears structured and well-organised.

На зараженном роллере вирус развивается более структурировано, образуя отчетливую «дорожку», как это обычно происходит на здоровом монослое / In the infected roller bottle, the virus exhibits structured development, forming a distinct “track”, as is typical on a healthy monolayer

Монослой, полученный из эмбрионов опытной группы /

Monolayer derived from embryos of the experimental group

В контрольном роллере монослой менее плотный, клетки расположены рыхло, с большими свободными пространствами. Видны отдельные скопления клеток и пустоты. Структура менее организована, присутствуют поврежденные клетки / In the control roller bottle, the monolayer is less dense; cells are arranged loosely, with large empty spaces. Isolated cell clusters and gaps are visible. The structure is less organised, and damaged cells are present.

На зараженном роллере вирус паротита выглядит менее структурированно, нет четкой «дорожки», вирус развивается беспорядочно / In the infected roller bottle, the mumps virus appears less structured; there is no clear “track”, and the virus develops irregularly

Это приводит к увеличению межклеточного пространства и утончению самого монослоя. Антибактериальный препарат влияет и на структуру монослоя: он становится рыхлым и более загрязненным скоплениями слипшихся клеток.

После передачи зараженных ИВС на проведение контроля специфической активности нами были получены следующие результаты, представленные в таблице 3.

Таким образом, можно заключить, что остаточное количество антибактериального препарата влияет и на функциональные характеристики клеточного монослоя, что критически важно при производстве вирусных вакцин. Вследствие ухудшения качества субстрата снижается специфическая активность ИВС, что приводит к отбраковке и снижению выхода продукта, а впоследствии – к увеличению затрат при производстве.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные в исследовании, соответствуют данным других авторов, указывающих на цитотоксическое и митохондриально-опосредованное действие фторхинолонов, в частности ципрофлоксацина, на эукариотические клетки. Так, в работах [3; 4] показано, что воздействие ципрофлоксацина приводит к нарушению структуры клеток, снижению адгезии и пролиферативной активности, что

Т а б л и ц а 3. Результаты контроля специфической активности

T a b l e 3. Results of specific activity monitoring

Номер ИВС (контрольная группа) / IVC number (control group)	Специфическая активность, lg ТЦД50 /0,5 мл / Specific activity, lg TCD50/0.5 ml	Номер ИВС (опытная группа) / IVC number (experimental group)	Специфическая активность, lg ТЦД50 /0,5 мл / Specific activity, lg TCD50/0.5 ml
1К / 1C	6,70	1ОП / 1Exp	5,7
2К / 2C	6,95	2ОП / 2Exp	5,2
3К / 3C	6,45	3ОП / 3Exp	6,2

Примечание: ИВС – индивидуальный вирусный сбор; ТЦД₅₀ – тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50 % клеток монослоя.

Note: IVC – individual viral collection; TCD50 – tissue cytopathogenic dose that causes the death of 50% of cells in a monolayer.

обусловлено ингибированием дыхательной цепи митохондрий и развитием оксидативного стресса. Аналогичные эффекты общей цитотоксичности антибиотиков фторхинолонового ряда описаны и в исследовании [4], где отмечено снижение жизнеспособности клеточных культур при их воздействии.

Кроме того, данные о системной токсичности и патофизиологических изменениях при хроническом воздействии остаточного количества ципрофлоксацина (включая иммуносупрессию и структурные изменения тканей) подтверждают выявленное в настоящей работе негативное влияние даже низкой концентрации антибиотика (0,0015 мг/кг) на эмбриональные клетки [5].

Таким образом, полученные результаты подтверждают современные представления о токсическом воздействии фторхинолонов, а также дополняют их, демонстрируя влияние остаточного количества антибактериального препарата непосредственно на качество клеточного субстрата, используемого в биотехнологическом производстве вирусных вакцин. В отличие от ранее опубликованных работ, в настоящем исследовании показана прямая связь между наличием остаточного количества антибактериального препарата в сырье и снижением как морфологических, так и функциональных характеристик клеточного монослоя, включая снижение специфической активности вируса паротита.

Исследование имеет ряд ограничений. Во-первых, объем выборки был небольшим, что может влиять на статистическую значимость полученных данных. Во-вторых, изучалось влияние только одного антибактериального препарата (ципрофлоксацина), тогда как в практике птицеводства применяется широкий спектр антибактериальных препаратов с различными механизмами действия. В-третьих, исследование проводилось на одной вирусной модели (вирус паротита), что не позволяет в полной мере экстраполировать результаты на другие вирусы, используемые в производстве вакцин.

Перспективы дальнейших исследований связаны с расширением экспериментальной базы и углублением анализа выявленных эффектов. В частности, представляется целесообразным изучение влияния других групп антибактериальных препаратов (аминогликозидов, тетрациклинов и др.) на клеточные культуры эмбрионального происхождения. Также необходимо исследовать воздействие остаточного количества антибактериальных препаратов на репродукцию различных вирусов, используемых в вакцинном производстве (например, вируса кори, краснухи).

Таким образом, результаты проведенного исследования подтверждают, что даже малое остаточное количество антибактериальных препаратов в перепелиных яйцах оказывает значимое негативное влияние на морфофункциональные характеристики клеточного монослоя. Это обосновывает необходимость усиления входного контроля сырья и разработки дополнительных регуляторных требований, направленных на обеспечение стабильности, эффективности и безопасности производства вирусных вакцин.