Влияние пептида HLDF6 на пролиферативную активность спленоцитов в культуре клеток на фоне введения агонистов опиатных рецепторов

Как известно, формирование синдрома наркотической зависимости сопряжено с изменением иммунного статуса организма [1-3]. Есть данные о способности ряда иммуномодуляторов снижать тяжесть абстинентного синдрома при лечении наркомании [1-4]. Это обусловлено тем, что между нейроэндокринной и иммунной системами существует тесная двусторонняя связь [1, 5-8], механизмы реализации которой привлекают пристальное внимание исследователей.

Важную роль в процессе коммуникации между нервной и иммунной системами играют опиоидные пептиды и специфические опиатные рецепторы. Многочисленными исследованиями установлено, что эндогенные опиоидные пептиды и синтетические агонисты опиатных рецепторов могут модулировать функции лимфоцитов, NK-клеток и макрофагов через присутствующие на их поверхности опиатные рецепторы трех основных типов: р, б и к [9-14].

В лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова из культуральной среды клеток человеческого промиелоци-тарного лейкоза HL-60 был выделен белок HLDF с молекулярной массой 8,2 кДа, который вызывал дифференцировку клеток по гранулоцитарному пути. В структуре пептида был обнаружен шестичленный фрагмент HLDF6 (TGENHR), который воспроизводил способность полноразмерного фактора индуцировать дифференцировку и ингибировать пролиферацию клеток HL-60 [15].

Ранее было показано, что введение HLDF6 подавляло проявление основных симптомов абстинентного синдрома у мышей [16], нормализовало показатели ноцицептивных реакций у потомства морфинто- лерантных животных [17]. В процессе исследования влияния пептида на функцию опиатной системы было установлено, что HLDF6 отменял анальгетический эффект агонистов р- и к-рецепторов [18], усиливал адгезивные свойства и функциональную активность перитонеальных макрофагов, ослаблял эффекты селективных агонистов опиатных рецепторов [19]. Эти данные свидетельствует о взаимодействии пептида и эндогенной опиатной системы ЦНС и клеток иммунной системы, хотя вопрос об особенностях реализации этой взаимосвязи, в частности, на иммунокомпетентных клетках изучен пока недостаточно.

Целью данной работы являлось исследование влияния пептида HLDF6 на пролиферативную активность лимфоцитов селезенки и его способности модулировать иммунорегуляторные эффекты селективных лигандов р, б и к -опиатных рецепторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве рецептор-специфических агонистов опиатных рецепторов были выбраны агонист μ-ре-цепторов DAGO (Tyr-D-Ala-Gly-(N-Me)Phe-Gly-ol), агонист δ-рецепторов DADLE (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu) и агонист к -рецепторов динорфин (1-13) (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys), полученные методом химического синтеза по специально разработанным методикам. Препараты DAGO и DADLE синтезировали по схемам (3 + 2). Синтез C-концевого сегмента DAGO проводили по специально разработанной трехстадийной схеме из 2-гидроксиэтиламида фенилаланина. Динорфин (1-13) синтезировали твердофазным методом на сти-рол-дивинилбензольной смоле Ванга с использованием Nsc-аминокислот. Пептид HLDF6 (Thr-Gly-Glu -Asn-His-Arg) был синтезирован методом активированных эфиров в растворе по авторской методике.

Спонтанную и индуцированную пролиферацию спленоцитов мышей линии C57Bl/6 оценивали после инкубации in vitro с пептидом HLDF6 и/или опиатными агонистами с помощью МТТ-теста по уровню восстановления клетками 3-(4,5-диметилти-азолил-2)-2,5-дифенил тетразолиум бромида (МТТ) [20]. Клеточную суспензию спленоцитов мышей готовили с использованием полной среды RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят (10 мМ Hepes, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина). Суспензию клеток распределяли по лункам 96-луночных круглодонных планшет по 100 мкл на лунку. Для индукции пролиферации использовали митоген – конканавалин А (ConA, ICN Biomedicals Inc) в концентрации 10 мкг/мл. Пептид добавляли в инкубационную среду непосредственно перед началом культивирования в концентрациях 0,01100 мкг/мл индивидуально либо в сочетании с опиатными агонистами (0,01-0,1 мкг/мл). Планшеты культивировали при температуре 37°С и 85-90% влажности в течение 72 ч. По окончании периода куль-55

тивирования во все лунки добавляли 20 мкл рабочего раствора МТТ с концентрацией 5 мг/мл, инкубировали в течение трех часов, после чего из лунок удаляли супернатант и вносили 200 мкл/лунку растворителя кристаллов красителя (формазана) – диметилсульфоксид (ДМСО). Планшеты оставляли при комнатной температуре на 30 минут, в течение которых происходило полное растворение кристаллов формазана. Оптическую плотность содержимого лунок замеряли с помощью спектрофотометра для микропланшетов при длине волны 540 нм.

Данные экспериментов подвергали статистической обработке с использованием пакета программ Statgrapfics 5.0 (Statistical Graphics Corp., USA). В качестве критерия статистической значимости обнаруженных межгрупповых различий был выбран t-критерий Стьюдента. Для подтверждения статистической значимости различий считали достаточным значение достигнутого уровня значимости (вероятности ошибочно принять отсутствие различий за их наличие) P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования было обнаружено, что внесение рецептор-специфических агонистов опиатных рецепторов в культуральную среду, как правило, приводило к повышению пролиферативной активности спленоцитов мышей. Однако интенсивность эффекта зависела как от типа агониста, так и от его дозы.

Повышение спонтанной пролиферативной активности клеток в результате воздействия на начальном этапе культивирования агониста д -рецепторов

DAGO            Динорфин (1-13)            DADLE

Рис. 1. Влияние агонистов опиатных рецепторов μ-, δ- и κ-типа DAGO, DADLE и динорфина (1-13) на спонтанную пролиферативную активность спленоцитов мышей.

* – различия статистически значимы по отношению к контролю (физиологический раствор), р≤0,05

DAGO наблюдалось в дозе 0,1 мкг/мл: показатели МТТ-теста возрастали по отношению к контрольному уровню на 50% (рис. 1). Инкубация спленоцитов с агонистом к -рецепторов динорфином (1-13) также стимулировала клеточную пролиферацию, причем особенностью воздействия данного агониста являлось то, что эффект носил дозозависимый характер и обнаруживался уже в минимальной использованной дозе. Повышение клеточной пролиферации составляло 55 и 133% при внесении препарата в концентрациях 0,01 и 0,1 мкг/мл, соответственно.

Наименьшей способностью стимулировать пролиферативную активность лимфоцитов обладал агонист δ-рецепторов DADLE, который в дозе 0,1 мкг/мл повышал показатели МТТ-теста лишь на 19%. Описанные различия в активности опиатных агонистов разных типов рецепторов сохранялись и на клетках, обработанных Т-клеточным митогеном конканава-лином А.

Анализ имеющихся литературных данных подтвердил тот факт, что селективные агонисты опиатных рецепторов разных типов способны модулировать пролиферативный ответ лимфоцитов, причем есть сведения как о стимулирующем, так и об ингибирующем эффектах этих препаратов. Так, установлено, что селективные агонисты д -, б- и к -рецепторов (DAGO, DPDPE, U-50488) являются потенциальными стимуляторами митоген-индуцированной пролиферации Т-лимфоцитов мышей в системе in vitro, которая отменялась селективными антагонистами соответствующих рецепторов [21, 22]. В работах [23, 24] приводятся данные о стимулирующем влиянии Динорфина на митогениндуцированную пролиферацию спленоцитов крыс, пролиферативный ответ спленоцитов мышей и продукцию ими IL-2 и IL-1 β .

С другой стороны, показано, что агонист δ-рецепторов (лей-энкефа-лин) в зависимости от используемой дозы может негативно регулировать митогениндуцированную пролиферацию, стимулируя клетки-супрессоры или клетки-хелперы иммунного ответа [25, 26]. Есть данные и о зависимости направленности эффекта селективных агонистов μ- и δ- рецепторов DAGO и DADLE от состава клеточной фракции [27].

Пептид HLDF6, подобно агонистам опиатных рецепторов, усиливал пролиферативный процесс в культуре клеток селезенки мышей. Показатели пролиферативной активности спленоцитов после инкубации с пептидом в концентрациях от 0,01 до 10 мкг/мл возрастали в 2,4-5,1 раза (показатель спонтан- ной активности) или 2,2-3 раза в условиях воздействия митогена (табл.). Добавление HLDF6 в дозе 100 мкг/мл не приводило к дальнейшему усилению эффекта, более того, отмечена тенденция к некоторому снижению показателей МТТ в этих лунках по сравнению с показателями, зарегистрированными после инкубации клеток с пептидом в дозе 10 мкг/мл.

Культивирование спленоцитов в среде, содержащей DAGO и HLDF6, приводило как к усилению, так и к ингибированию способности клеток восстанавливать МТТ по сравнению с показателями, зарегистрированными в лунках с добавлением одного DAGO. При этом направленность эффекта зависела от концентрации агониста и интенсивности вызванной им реакции (рис. 2). Так, добавление пептида в среду, содержащую DAGO в концентрации 0,01 мкг/мл, которая не вызывала статистически значимого изменения спонтанной пролиферации спленоцитов, приводило к значительному повышению показателей МТТ-теста, превышавшему контрольный уровень в

1,5-1,8 раза. В том случае, когда результатом внесения DAGO (0,1 мкг/мл) являлось значительное повышение уровня пролиферативной активности клеток, пептид ослаблял эффект опиатного агониста. Те же закономерности были обнаружены при оценке последствий совместного применения агониста μ-ре-цепторов и HLDF6 в культуре клеток, индуцированных внесением в среду конканавалина А, где пептид в концентрациях 0,01 и 0,1 мкг/мл ослаблял стимулирующий эффект DAGO (0,1 мкг/мл) на пролиферацию митоген-индуцированных спленоцитов. Наиболее выраженный эффект был отмечен при использовании препаратов DAGO и HLDF6 в концентрациях 0,1 и 1 мкг/мл, соответственно, то есть при десятикратном избытке пептида.

Усиление под действием пептида HLDF6 спон- танной пролиферации спленоцитов в условиях слабо выраженного эффекта опиатного агониста наблюдалось и в экспериментах с использованием аго- ниста к-рецепторов динорфина (рис. 3). Отличи-

Таблица

тельной особенностью этих экспериментов являлось отсутствие

Пролиферативная активность спленоцитов мышей С57ВL/6 при культивировании в среде с добавлением пептида HLDF6

Препарат	Концентрация, мкг/мл	Уровень восстановленного МТТ, о.е.
		спонтанный	митогениндуцированный
Физраствор	–	0,155±0,189	0,335±0,043
HLDF6	0,01	0,352±0,014*	0,734±0,030*
	0,1	0,564±0,015*	0,884±0,031*
	1,0	0,732±0,028*	1,030±0,031*
	10,0	0,767±0,015*	1,017±0,011*
	100,0	0,630±0,027*	0,947±0,039*

* – различие статистически значимо по отношению к контролю (физиологический раствор), р<0,05.

Рис. 2. Показатели спонтанной пролиферативной активности спленоцитов мышей при культивировании с агонистом опиатных μ-рецепторов DAGO и пептидом HLDF6.

Различия статистически значимы (р<0,05): * – по отношению к контролю (физиологический раствор); ** – по отношению к показателям в лунках, содержащих DAGO в соответствующей концентрации

статистически значимого ингибирующего эффекта пептида в условиях выраженной активации спонтанной пролиферативной активности клеток, вызванной динорфином. Кроме того, не было зарегистрировано сколько-либо значимого влияния HLDF6 на показатели митогениндуци-рованной пролиферации клеток на фоне добавления динорфина.

Внесение HLDF6 в среду культивирования, содержащую DADLE, в соотношении 1:1 и 10:1 не оказывало существенного влияния на показатели спонтанной и индуцированной пролиферативной активности, за исключением незначительного усиления эффекта агониста в концентрации 0,01 мкг/мл (на 21% по отношению к показателям в лунках с добавлением одного DADLE) (рис. 4).

Таким образом, установлено, что пептид HLDF6 обладал способностью модулировать эффекты агонистов разных типов опиатных рецепторов, изменяя как спонтанную, так и митоген-индуцированную активность лимфоцитов селезенки. Направленность эффекта пептида зависела от типа агониста и интенсивности вызванной им реакции.

Рис. 3. Показатели спонтанной пролиферативной активности спленоцитов мышей при культивировании с агонистом опиатных κ-рецепторов динорфином (1-13) и пептидом HLDF6. Различия статистически значимы (р<0,05): * – по отношению к контролю (физиологический раствор); ** – по отношению к показателям в лунках, содержащих динорфин в соответствующей концентрации

Рис. 4. Показатели спонтанной пролиферативной активности спленоцитов мышей при культивировании с агонистом опиатных δ-рецепторов DADLE и пептидом HLDF6. Различия статистически значимы (р<0,05): * – по отношению к контролю (физиологический раствор); ** – по отношению к лункам, содержащим DADLE в соответствующей концентрации

мом ингибирующего эффекта HLDF6 могут быть конформационные изменения структуры ионных каналов, в частности кальциевых, которые подвержены регуляции опиатными пептидами [15]. В связи с этим не исключено, что эффект HLDF6 на функциональное состояние спленоцитов может быть обусловлен деблокированием Ca2+-каналов, вызванным опиатами, и активацией Ca2+-кальмодулин-опосредованных путей передачи клеточного сигнала.

Таким образом, показано, что агонисты р-, б- и к -опиатных рецепторов (DAGO, DADLE, динорфин (1-13)) обладают способностью модулировать пролиферативную активность спленоцитов при их прямом взаимодействии с клетками. Направленность и интенсивность эффекта определялись типом агониста и, соответственно, опиатного рецептора. Пептид HLDF6 повышал пролиферативную активность спленоци-тов при добавлении его в инкубационную среду на начальном этапе культивирования. Данные, касающиеся совместного использования HLDF6 и опиатных агонистов, свидетельствуют о взаимодействии пептида и эндогенной опиатной системы. Направление эффекта пептида зависело от типа опиатного агониста и используемой дозы.

Механизмы модуляторного эффекта HLDF6 на спленоциты пока неясны. Известно, что связывание рецептор-специфических агонистов с опиатными рецепторами разных типов на поверхности клетки приводит к снижению активности аденилатциклазы и уровня цАМФ в клетке [28]. Добавление HLDF6 к активно пролиферирующим клеткам HL-60 вызывало аналогичные изменения (уменьшение синтеза цАМФ и фосфорилирования белков клетки) [29]. Однако подобная схема, если она верна и в отношении лимфоцитов, может объяснить только потенцирующий эффект HLDF6.

С другой стороны, как было установлено ранее, HLDF6 вызывает модификацию физико-химических свойств клеточной мембраны, повышая ее текучесть [15]. Следовательно, возможным механиз-