Влияние перемешивания на эффективность ферментативного гидролиза высококонцентрированных сред экструдированного крахмала кукурузы

Ферментативный гидролиз при высоком содержании сухих веществ субстрата является более целесообразным в экономическом и технологическом аспектах способом биокатализа растительного сырья, так как обеспечивает целый ряд преимуществ, в том числе более низкие капитальные затраты на аппаратурнотехнологическое оформление процесса при идентичной производственной мощности, снижение энергетической и экологической нагрузки на производство и окружающую среду [1, 2]. Однако конечная конверсия углеводов может снижаться с увеличением концентрации сухих веществ из-за более высокой начальной вязкости и концентрации продуктов гидролизов. Высокая вязкость может создать реологические проблемы, вызвать недостаточное перемешивание, снизить эффективность теплопередачи в системе реакторов, что приведет к низкому преобразованию углеводов [3]. Для решения подобных проблем разрабатываются альтернативные способы гидролиза растительного сырья, замещающие стадию водно-тепловой обработки или разваривания под давлением более интенсивными процессами, позволяющие исключить пики вязкости и возможные реологические проблемы. Одним из направлений является термопластическая экструзия и ее интеграция в процесс биоконверсии растительного сырья в различных вариантах [4]. Это может быть внесение биокатализатора непосредственно в камеру экструдера при высоком содержании влаги в экструзионной камере [1] или при стандартных для сухой экструзии режимах [5, 6], а также соединения экструдера с трубчатой гидролитической камерой, в которой происходит формирование гидролизата и начинается биокатализ [7]. Тем не менее, во всех указанных способах для обеспечения высокой степени биоконверсии требуется длительное время экспозиции субстрата с ферментом в условиях, оптимальных для действия ферментного препарата. Одним из важных факторов, как было указано выше, является перемешивание, в том числе как одна из составляющих энергозатрат в процессе гидролиза, особенно при повышенных концентрациях субстрата. Рядом авторов проведены исследования, касающиеся указанного аспекта процесса ферментативного гидролиза.

В технологии биоэтанола из биомассы древесины ели изучено влияние интенсивности перемешивания на скорость и степень гидролиза [8]. Например, биоконверсия была вдвое

Изучены различные способы гидролиза пшеничных отрубей ксиланазой, включающие стационарную инкубацию высококонцентрированной среды без перемешивания, предварительно проэкструдированной при температуре, оптимальной для действия ксиланазы, а также биоконверсию низкоконцентрированной среды, но с постоянным перемешиванием [10]. Процесс с использованием экструдера для первоначального формирования гидролизуемой массы обеспечил эффективное действие ксиланазы на пшеничные отруби при содержании сухих веществ до 60% без необходимости непрерывного перемешивания, вероятно, из-за усиленной диффузии ферментного препарата.

Ферментативный гидролиз крахмала и крахмалсодержащего сырья в процессах пищевой биотехнологии в отличие от биоконверсии некрахмалистых полисахаридов является менее продолжительным. При этом в производстве сахаристых крахмалопродуктов концентрация сухих веществ на стадии водно-тепловой и ферментативной обработки составляет обычно 30–35% [11, 12] и лимитируется ухудшением реологических свойств гидролизатов. Экструзионно-гидролитическая технология, позволяющая исключить некоторые стадии водно-тепловой обработки, позволяет повысить концентрацию гидролизуемых сред крахмала до 50% сухих веществ [13], при этом ввиду высокой концентрации на начальной стадии биокатализа значения динамической вязкости данных сред достаточно высокие, что может накладывать ограничения на процессы их перемешивания и перекачивания по технологическим трубопроводам.

Цель работы – изучение влияния фактора перемешивания на гидролиз и реологические свойства высококонцентрированных крахмалистых сред проэкструдированного кукурузного крахмала.

Материалы и методы

Объектом исследований являлся кукурузный крахмал по ГОСТ 32159–2013 «Крахмал кукурузный» влажностью 12%.

Ферментативный гидролиз экструдированного крахмала проводили в термостатированной емкости с концентрацией сухих веществ 50% при температуре 60 ºС в течение 4 часов. Перемешивание осуществлялось рамной мешалкой, скорость вращения которой в экспериментах составляла 100, 200 и 500 об/мин.

В качестве амилолитических ферментных препаратов использовали мезофильную α-амилазу активностью 3500 ед. АС/см3 и глюкоамилазу активностью 13500 ед. ГлС/см3. Активность α-амилазы определяли по количеству прогидролизованного крахмала в результате его гидролиза ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы при рН 6,0, температуре 30 °С в течение 10 минут. За единицу активности (АС) принимали такое количество фермента, которое катализировало гидролиз 1 г растворимого крахмала до декстринов различной молекулярной массы, что составляет 30–50% от количества крахмала, введенного в реакцию. Количество прогидро-лизованного крахмала определяли колориметрическим методом по разнице между интенсивностью окраски с раствором йода исходного и остаточного крахмала. Глюкоамилазную активность (ГлС) определяли методом количественного определения глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала глюкоамилазой при температуре 30 ºС, значении рН 4,7 и длительности 10 минут. За единицу глюкоамилазной активности принимали такое количество фермента, которое высвобождало за 1 мин 1 мкмоль глюкозы.

В соответствии с дизайном эксперимента, на первом этапе изучалось влияние скорости перемешивания на гидролиз высококонцентрированной среды при дозировке ФП: 4 ед. АС/г крахмала и 6 ед. ГлС/г крахмала. На втором этапе оценивалось, как увеличение дозировки глюкоамилазы, фермента, оказывающего слабое влияние на реологические свойства гидролизатов, но при этом специфичного

Степень гидролиза характеризовали по дек-трозному эквиваленту (ДЭ), значения которого оценивали по ГОСТ Р 50549–93 «Продукты гидролиза крахмала. Определение восстанавливающей способности и эквивалента глюкозы. Метод постоянного титра Лейна и Эйнона».

Отбор проб для определения декстрозного эквивалента и динамической вязкости гидролизатов проводили каждый час с момента начала гидролиза.

Исследования проведены в двух повторностях. Достоверность различий средних проводили методом дисперсионного анализа с применением апостериорного анализа по критерию Тьюки при p < 0,05 с использованием пакета программ Statistica 6.0.

Результаты

На первом этапе изучали непосредственное влияние перемешивания на качество биокатализа высококонцентрированного гидролизата экструдата кукурузного крахмала при дозировке α-ами-лазы 4 ед. АС/г крахмала и глюкоамилазы 6 ед. ГлС/г крахмала. На рисунке 1 представлены данные по влиянию скорости перемешивания на декстрозный эквивалент гидролизата с концентрацией 50% сухих веществ.

На момент 1 часа гидролиза значения ДЭ для сред, перемешиваемых с частотой 200 и 500 об/мин, были статистически неразличимы. Относительно среды, инкубируемой без перемешивания, ДЭ за счет интенсивного массообмена увеличился на 55–56% c 28,3 до 44, для гидролизата, перемешиваемого с частотой 100 об/ мин, – только на 14,8%. Стоит отметить, что значения ДЭ гидролизатов с перемешиванием 200 и 500 об/мин статистически не различались на протяжении всего времени гидролиза в течение 4 часов. При этом с увеличением времени экспозиции различие в ДЭ от сред, гидролизуемых в условиях неинтенсивного массобмена сокращались. Так, на момент 4 часов гидролиза ДЭ гидролизата, инкубируемого без перемешивания, составлял 52,2, гидролизатов, перемешиваемых с частотами 100, 200 и 500 об/мин, соответственно, 54,5; 59,3 и 59,8.

Время гидролиза, ч | Hydrolysis time, h

Частота вращения мешалки, об/мин | Agitation rate, rpm

□0  ■ 100 □ 200 Q 500

Рисунок 1. Влияние частоты перемешивания на динамику изменения декстрозного эквивалента гидролизатов при дозировке ФП 4 ед. АС/г крахмала и 6 ед. ГлС/г крахмала

Figure 1. Influence of agitation rate on the dynamics of changes in dextrose equivalent of hydrolysates at enzymes dosages of 4 Units of amylolytic activity per 1 g of starch and 6 Units of glucoamylase activity per 1 g of starch

На рисунке 2 представлена зависимость изменения динамической вязкости гидролизатов от частоты перемешивания в течение биокатализа. В период формирования гидролизуемой среды как и в случае с показателем ДЭ реологические свойства сред, перемешиваемых со скоростью 200 и 500 об/мин, статистически не различались друг от друга, при этом значимо отличались от гидролизата, инкубируемого без перемешивания, и среды с перемешиванием 100 об/мин. После 4 часов гидролиза вязкость всех гидролизатов снизилась значительно.

0,1

Врем1я гидролиза, ч | H2ydrolysis time, h 3 Частота вращения мешалки, об/мин | Agitation rate, rpm

И0   ■ 100   О 200   Q 500

Рисунок 2. Влияние частоты перемешивания на изменение динамической вязкости гидролизатов при дозировке ФП 4 ед. АС/г крахмала и 6 ед. ГлС/г крахмала

Figure 2. Influence of agitation rate on the dynamic viscosity of hydrolysates at enzymes dosages of 4 Units of amylolytic activity per 1 g of starch and 6 Units of glucoamylase activity per 1 g of starch

Из представленной диаграммы видно, что на протяжении всего периода биокатализа за исключением начального этапа динамическая вязкость неперемешиваемого гидролизата значимо превышает этот показатель у перемешиваемых сред. Тем не менее, вязкость указанного образца сократилась с 3 Па×с до 0,35 Па×с.

Динамическая вязкость гидролизата, полученного с самым интенсивным перемешиванием 500 об/ мин в процессе биокатализа снизилась с 2,54 Па×с до 0,145 Па×с.

Изучен эффект увеличения дозировки глюкоамилазы на степень гидролиза экструдированного крахмала кукурузы в различных условиях массобмена – с перемешиванием и без.

Сравнение различных вариантов биокатализа представлено на диаграмме рисунка 3. Данный эксперимент можно рассматривать как оценку влияния сразу трех факторов на ДЭ продуктов гидролиза: время экспозиции, скорость перемешивания и дозировка глюкоамилазы. По истечении 1 часа гидролиза минимальное значение ДЭ, которое составило 32,5, было отмечено для образца без перемешивания с дозировкой ФП 4 ед. АС и 6 ед. ГлС на 1 г крахмала, а максимальное – для образца с перемешиванием и дозировкой ФП 4 ед. АС и 12 ед. ГлС на грамм крахмала. ДЭ данного варианта оставался максимальным на протяжении всего периода наблюдения и на 4 часа биокатализа составил 71. Вообще, с течением времени на момент 4 часов гидролиза ДЭ для всех образцов увеличился значимо и прирост составил 36–100%. Минимальный прирост соответствовал образцам с перемешиванием, так как уже на начальном периоде гидролиза степень биокатализа крахмала в них была значимо выше. В первые два часа гидролиза именно фактор перемешивания был более значимым, чем фактор увеличения дозировки глюкоамилазы. В этот период ДЭ образцов с перемешиванием был выше на 29–37%. Но с течением времени для вариантов с увеличенной дозировкой глюкоамилазы можно отметить, что различие ДЭ на момент 3 и 4 часов гидролиза становится статистически незначимым.

Дозировка ФП: 4 ед. АС/ г крахмала, 6 ед. ГлС/ г крахмала

Enzymes dosages: 4 Units of amylolytic activity, 6 Units of glucoamylase activity/1 g of starch

Дозировка ФП: 4 ед. АС/ г крахмала, 12 ед. ГлС/ г крахмала

Enzymes dosages: 4 Units of amylolytic activity, 12 Units of glucoamylase activity/1 g of starch мешалки, об/мин Agitation rate, rpm и0    ■ 200

□0    в 200

Рисунок 3. Влияние частоты перемешивания на динамику изменения декстрозного эквивалента при дозировке ФП 4 ед. АС/г крахмала, 6 ед. ГлС/г крахмала и 12 ед. ГлС/г крахмала

Figure 3. Influence of agitation rate on the dynamics of changes in dextrose equivalent of hydrolysates at enzymes dosages of 4 Units of amylolytic activity per 1 g of starch, 6 and 12 Units of glucoamylase activity per 1 g of starch

Обсуждение

Переход к высококонцентрированным средам в биотехнологии относительно новая тенденция, связанная как с развитием новых способов организации процессов биоконверсии, так и возможностью использования новых, высокоэффективных ферментных препаратов. В задачи нашего исследования в аспекте развития экструзионно-гидролитической технологии входила необходимость оценки возможности проведения ферментативного гидролиза уже сформированного гидролизата экструдированного крахмала без перемешивания в течение нескольких часов. Стратегия перехода на переработку повышенных концентраций пшеничных отрубей, описываемую в работе Сантала с коллегами [10], оказалась вполне успешной, при условии смешивания и формирования катализируемой среды (смесь отрубей, воды и ксила-назы) в экструдере. Используя похожий подход, отличающийся только способом формирования гидролизата, за счет того, что вязкость концентрированных гидролизатов экструдированного крахмала значительно ниже вязкости сред с большим количеством некрахмалистых полисахаридов, мы имели возможность не просто сравнить два способа биоконверсии: высоко-концентированной среды без перемешивания и низкоконцентрированной с перемешиванием, а изучить непосредственно влияние фактора перемешивания.

В исследовании ферментативного гидролиза глюкана древесной биомассы в глюкозу [8] установлено, что скорость вращения мешалки значимо влияла на качество биокатализа как при низкой, так и при высокой дозировке ФП. При максимальной частоте вращения 500 об/мин конверсия через 48 часов составила 57% в сравнении с 26% при скорости пермешивания 25 об/мин. Для обеих дозировок ферментов при этом наблюдалась почти линейная зависимость между скоростью перемешивания и конверсией. Отмечено, что положительный эффект перемешивания сохранялся на протяжении всего процесса гидролиза. Если сравнивать данные наблюдения с результатами экспериментов нашего исследования, то можно выделить несколько отличий в тенденциях с учетом различия в сырье. В нашем случае фактор перемешивания значим только при нижнем для эксперимента уровне дозировки фермента глюкоамилазы. Так, на момент 4 часов ДЭ гидролизата, перемешиваемого со скоростью 500 об/мин, был выше на 9% гидролизата с перемешиванием 100 об/мин и на 15% – без перемешивания. Но при высокой дозировке глюкоамилазы фактор перемешивания был значим только в первые 2 часа гидролиза. Значимость повышения дозировки ФП при комбинировании различных режимов биоконверсии показана в исследовании ферментативного гидролиза целлюлазой пивной дробины [14]. Установлено, что самые высокие значения качественных показателей, выхода глюкозы и конверсии целлюлозы, 93,1 и 99,4%, соответственно, были получены при самых низких в опыте частоте перемешивания (100 об/мин) и концентрации субстрата, а также максимальной дозировке ФП. Анализ управляющих факторов эксперимента показал, что только дозировка фермента оказывала значимое влияние на степень конверсии. Две другие исследуемые переменные, скорость перемешивания и концентрация субстрата, не оказали значительного влияния на выход глюкозы. Аналогичная тенденция отмечена для конверсии глюкана во время гидролиза при высокой 300 об/мин и низкой 100 об/мин интенсивности перемешивания [9]: при сравнении биокатализа при низком и высоком содержании твердых веществ (7 и 13%) показано, что более высокая скорость перемешивания не улучшила гидролиз по сравнению с исходным уровнем с низким содержанием твердых веществ. Однако низкая интенсивность перемешивания 100 об/мин значительно снизила скорость гидролиза при высокой концентрации субстрата. Таким образом, по литературным данным и результатам исследования можно сделать вывод, что перемешивание конечно является важным аспектом проведения процесса биоконверсии, но многое определяет и концентрация среды, а еще больше – дозировка ФП. Увеличение дозировки глюкоамилазы вдвое по результатам 4 часов обработки позволило увеличить ДЭ на 18–35%, а главное – нивелировать различие в степени гидролиза сред с перемешиванием и без, ДЭ в данных опытах составил 71 и 70, соответственно. Видимо, такое количество ФП в сочетании с высокой концентрацией среды, но относительно низкой вязкостью было достаточным, чтобы обеспечить тоже качество гидролиза, что и с интенсивным массобменом.

Заключение

Проведенное исследование показало, что при осуществлении гидролиза высококонцентрированных сред при условии качественной гомогенизации среды с ферментом даже без перемешивания возможно обеспечить высокую степень конверсии биополимеров растительного сырья. Этот аспект проведения гидролиза является важным, так как на начальном этапе гидролиза динамическая вязкость гидролизуемых сред с высоким содержанием проэкструдиро-ванного крахмала 50% и выше все-таки может вызывать проблемы с их перемешиванием и перекачиванием. Но уже после 1 часа гидролиза вязкость значительно снижается, даже если гидролизат не перемешивали. В аспекте высокой степени биоконверсии при таком способе гидролиза необходимо отметить важное значение термопластической экструзии, которая значительно повышает ферментативную атакуе-мость крахмалистых субстратов амилолитическим ферментными препаратами.