Влияние полиморфизма генов апоптоза и репарации на эффективность неоадъювантной химиотерапии злокачественных новообразований

Использование неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) при комбинированном лечении злокачественных новообразований приводит к ряду положительных эффектов. Во-первых, это уменьшение объема первичной опухоли при операбельных формах рака, что дает возможность выполнять органосохранные операции или уменьшать объем выполняемой радикальной операции. Во-вторых, определение чувствительности первичной опухоли к проводимой химиотерапии in vivo, по результатам оценки эффективности НАХТ, позволяет адекватно пла- нировать адъювантное лекарственное лечение. В-третьих, достигается улучшение отдаленных результатов лечения, особенно при достижении полной, морфологически подтвержденной, регрессии опухоли [3, 6, 12, 14, 16, 17, 19, 20, 26]. Клиническими исследованиями установлены показания для проведения НАХТ при целом ряде злокачественных новообразований, к которым, в первую очередь, относятся рак молочной железы (РМЖ) и местнораспространенный немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). Однако при этих локализациях предоперационная химиотерапия обеспечивает не более 30–50 % эффективности, в результате чего остальные больные, не имея шансов получить положительные результаты от цитостатической терапии, подвергаются воздействию высокотоксичных препаратов и риску возникновения побочных эффектов [19, 22]. Отсутствие единой точки зрения в отношении показаний к проведению НАХТ и критериев, определяющих выбор схемы, обусловливает высокую актуальность поиска предсказательных маркеров эффективности химиотерапии (ХТ).

В настоящее время в качестве «золотого стандарта» НАХТ при раке молочной железы приняты антрациклин- и таксансодержащие схемы – CAF и FAC, при НМРЛ – комбинация производных платины с таксанами (таксотер, паклитаксел) или антиметаболитами (гемзар, гемцитабин) [2, 6, 8]. Цитотоксическое действие большинства противоопухолевых препаратов, применяемых при РМЖ, независимо от конкретных механизмов действия, в конечном итоге реализуется путем индукции программируемой клеточной гибели (апоптоза) опухолевых клеток [13, 18]. Основным эффектом препаратов группы платины является прямое повреждение ДНК и образование цисплатин-ДНК-аддуктов, что приводит к активации белка р53 и остановке клеточного цикла для репарации ДНК. В том случае, если повреждения ДНК своевременно не подвергаются репарации или элиминации, клетки гибнут путем апоптоза, при этом происходит уменьшение размеров опухоли. Чувствительность клеток опухоли к ХТ, таким образом, может существенно зависеть от активности генов, регулирующих процессы репарации и апоптоза. Известно, что функциональная активность продуктов генов может быть существенно изменена в результате генетического полиморфизма (ГП), который подразумевает наличие в первичной структуре ДНК небольших изменений в нуклеотидных последовательностях, которые совместимы с нормальной функцией генома в онтогенезе, но часто приводят к появлению белковых продуктов с измененными физикохимическими свойствами, в результате которых могут существенно нарушаться их функции [1]. Очевидно, что ответ на химиотерапию может различаться у индивидуумов, несущих раз- личные по функциональной активности аллели генов, контролирующих процессы репарации и апоптоза. Представленные в мировой литературе сведения по этому вопросу носят противоречивый характер, что может быть связано как с особенностями распределения генотипов изучаемых генов в разных популяциях, так и с недостаточной изученностью функционального проявления исследуемых полиморфизмов, в частности, в условиях использования химиопрепаратов с различными механизмами действия [5, 6, 9, 23]. Это делает актуальными дальнейшие исследования в данном направлении с целью выявления молекулярных факторов, по которым можно было бы судить о чувствительности опухоли к химиотерапии.

Цель исследования – изучить ассоциацию полиморфизма гена онкосупрессора TР53 и гена репарации XRCC1 с эффективностью НАХТ у больных раком молочной железы и немелкоклеточным раком легкого.

Материал и методы

Исследование проводилось с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288). Получено разрешение этического комитета НИИ онкологии СО РАМН (г. Томск). В исследование вошли 84 больных НМРЛ, у большинства из которых – 67 человек – была диагностирована IIIА–IIIВ стадии процесса, в возрасте 58,9 ± 7,4 года, получавших НАХТ по схемам гемцитабин + цисплатин, паклитаксел + карбоплатин, доцетаксел + цисплатин, и 192 больные РМЖ стадии T1–4N0–2M0 в возрасте 50,0 ± 7,4 года, получавших НАХТ по схемам, содержащим метотрексат (CMF, CMF + кселода) и антраци-клины (CAF, FAC, CAF + кселода).

Непосредственная эффективность НАХТ определялась клиническими, инструментальными и морфологическими методами по критериям ВОЗ и оценивалась как полная регрессия, частичная регрессия, стабилизация или прогрессирование опухолевого роста. Стандартно оценка эффективности НАХТ проводится после 2-го курса химиотерапии, и достижение частичной регрессии опухоли является показанием к ее

Таблица 1

Ген	Последовательность праймеров	Метод, фермент рестрикции	Температура отжига, ˚С
XRCC1 rs25487	GCCCCGTCCCAGGTAA AGCCCCAAGACCCTTTCACT	ПЦР-ПДРФ MspI	55
TP53
Интрон 3 rs17878362	TGGGACTGACTTTCTGCTCTT TCAAATCATCCATTGCTTGG	ПЦР	57
Экзон 4 rs1042522	CTGGTAAGGACAAGGGTTGACTGACCGTGCAAGTCACAG	ПЦР-ПДРФ BstU1	63
Интрон 6 rs1625895	TGGCCATCTACAAGCAGTCA TTGCACATCTCATGGGGTTA	ПЦР-ПДРФ MspI	57

Условия анализа полиморфизма генов

продолжению. При стабилизации процесса или прогрессировании рассматривались варианты хирургического лечения либо смены схемы химиотерапии.

В работе проведено генотипирование гена репарации XRCC1 (G399A полиморфизм в 10 экзоне (rs25487)), кодирующего белок эксцизионной репарации, и гена ТР53 (G199C полиморфизм в 72 кодоне 4 экзона (rs1042522) и интронах 3 (дупликация 16 пар нуклеотидов (rs17878362)), и 6 (G13494A, (rs1625895)), кодирующего одноименный белок, инициирующий каскад событий в клетке в ответ на повреждение ДНК (табл. 1).

Геномная ДНК была выделена из цельной венозной крови с использованием протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией [4]. Оценка полиморфизмов генов проводилась с помощью ПЦР-ПДРФ (Полимеразной Цепной Реакции – Полиморфизма Длин Рестрикционных Фрагментов) анализа.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий χ ² Пирсона [7, 10]. Для всех изученных полиморфных вариантов генов в выборках пациентов распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии Харди–Вайнберга.

Результаты и обсуждение

Проведено сравнение частот генотипов и аллелей гена TP53 и XRCC1 у больных НМРЛ и РМЖ с разной эффективностью НАХТ. Поскольку при раке легкого не было отмечено полной регрессии опухоли и прогрессирования ее роста, сравнивали между собой группы больных с частичной регрессией и стабилизацией опухолевого процесса.

Не найдено взаимосвязи между носительством того или иного генотипа или аллеля гена ТР53 (экзон 4, интрон 3 и 6) и эффективностью НАХТ в общей группе больных НМРЛ (данные не представлены). При разделении больных по стадиям выявлены ассоциации у больных НМРЛ IIIA–IIIB стадии (табл. 2). В частности, в группе больных с частичной регрессией опухоли была значимо повышена частота гетерозиготного генотипа Arg/Pro гена TP53 по сравнению с группой со стабилизацией процесса (58 % против 33 %, р=0,044), что свидетельствует о более высокой эффективности НАХТ среди носителей гетерозиготных генотипов, содержащих оба аллеля.

Полученные результаты не противоречат данным китайских ученых [28] о том, что у больных НМРЛ применение препаратов платины в режиме НАХТ эффективнее среди лиц, несущих Pro аллель ТР53 гена. В то же время корейские исследователи показали, что Pro/ Pro генотип 4 экзона гена ТР53 ассоциирован с резистентностью НМРЛ к НАХТ, содержащей препараты платины [15]. Действительно, форма белка р53Pro, менее эффективная в индукции апоптоза, не обеспечивает адекватной гибели опухолевых клеток в отсутствие аргининовой формы р53Arg. В то же время у носителей обоих

Таблица 2

Распределение генотипов генов TP53 и XRCC1 у больных НМРЛ IIIA–IIIB стадии в зависимости от эффективности НАХТ

Генотипы и аллели генов Частичная регрессия опухоли, абс.ч. (%) Стабилизация процесса, абс.ч. (%) р ТР53 4 экзон Arg/Arg 9 (38) 23 (57) 0,12 Arg/Pro 14 (58) 13 (33) 0,04 Pro/Pro 1 (4) 4 (10) 0,64 Arg 32 (66) 59 (74) 0,39 Pro 16 (34) 21 (26) XRCC1 Arg/Arg 12 (52) 13 (32,5) 0,12 Arg/Gln 9 (39) 13 (32,5) 0,59 Gln/Gln 2 (9) 14 (35) 0,03 Arg 33 (72) 39 (49) 0,02 Gln 13 (28) 41 (53) XRCC1+ ТР53 Arg/Arg+ Arg/Arg 6 (24) 6 (15) 0,36 Arg/Arg + Arg/Pro 7 (28) 5 (12) 0,18 Arg/Arg + Pro/Pro 1 (4) 2 (5) 0,67 Arg/Gln + Arg/Arg 4 (16) 8 (20) 0,75 Arg/Gln +Arg/Pro 5 (20) 3 (8) 0,24 Arg/Gln + Pro/Pro - 2 (5) - Gln/Gln + Arg/Arg - 9 (23) - Gln/Gln + Arg/Arg 2 (8) 5 (12) 0,69 Gln/Gln +Pro/Pro - - - аллелей уровень апоптоза может быть достаточно высок в связи с тем, что р53Pro высокоактивен в отношении ареста клеточного цикла при повреждении ДНК, тем самым обеспечивая высокий уровень апоптоза аргининсодержащим р53 [23]. Противоречивость литературных сведений может быть обусловлена и тем, что чувствительность к цитостатическому воздействию может снижаться при наличии соматических мутаций в гене ТР53 в опухолевых клетках, которые препятствуют их апоптотической гибели, что подтверждено при использовании у больных НМРЛ химиотерапии по схеме цисплатин и гемцитабин [24]. В исследуемых нами группах больных частота мутаций гена TP53 составляет около 60 % для НМРЛ и РМЖ [5, 11], это указывает на целесообразность учета его соматического статуса при оценке эффективности лечения.

Анализ полиморфизма 10 экзона гена репарации XRCC1 выявил, что носительство минорного Gln аллеля (менее активного по способности к репарации ДНК) не приводит к повышению эффективности НАХТ. Среди больных НМРЛ с частичной регрессией опухоли носители генотипа Gln/Gln составили 9 %, против 35 % в группе со стабилизацией роста опухоли (р=0,033), при этом шанс не ответить на лечение у таких больных значительно выше, чем у носителей мажорного генотипа Arg/Arg (OR=5,65; CI95%=1,03–40, р=0,04). Частота Arg аллеля составила 72 % в группе больных НМРЛ с частичной регрессией опухоли против 49 % при стабилизации процесса, р=0,02 (табл. 2). Исследователями из Китая [25] также показано, что ответ НМРЛ после 2–3 курсов НАХТ по схемам, включавшим цисплатин или карбоплатин, был намного выше среди пациентов, несущих Arg/Arg генотип гена XRCC1, нежели Arg/Gln или Gln/Gln. Эти данные противоречат результатам, полученным на базе ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, свидетельствующим о том, что наличие генотипа

Таблица 3

Генотипы и аллели генов	Ответ опухоли на НАХТ, абс.ч. (%)		р
	Есть	Нет
ТР53
Arg/Arg	41(52)	52 (48)	0,61
Arg/Pro	33 (42)	46 (43)	0,91
Pro/Pro	5 (6)	10 (9)	0,46
Arg	115 (73)	150 (69)	0,48
Pro	43 (27)	66 (31)
XRCC1
Arg/Arg	39 (55)	39 (41)	0,07
Arg/Gln	27 (38)	49 (51)	0,08
Gln/Gln	5 (7)	7 (7)	0,82
Arg	105 (74)	127 (67)	0,16
Gln	37 (26)	63 (33)
ТР53+ XRCC1
Arg/Arg+ Arg/Arg	20 (28)	22 (23)	0,46
Arg/Arg+ Arg/Gln	17 (24)	20 (21)	0,65
Arg/Arg+ Gln/Gln	1 (1)	2 (2)	0,95
Arg/Pro+ Arg/Arg	16 (23)	15 (16)	0,26
Arg/Pro+ Arg/Gln	9 (13)	23 (24)	0,09
Arg/Pro+ Gln/Gln	3 (4)	3 (3)	1,00
Pro/Pro+ Arg/Arg	3 (4)	2 (2)	0,65
Pro/Pro+ Arg/Gln	1 (1)	6 (6)	0,24
Pro/Pro+ Gln/Gln	1 (1)	2 (2)	1,00

Распределение генотипов генов TP53 и XRCC1 у больных РМЖ с различной эффективностью НАХТ

Arg/Arg гена XRCC1 может являться причиной неэффективности химиотерапии, в частности, риск невосприимчивости к комбинированной терапии оксалиплатином и 5-фторурацилом у больных, несущих, по крайней мере, один аллель Arg, в 5,2 раза выше, чем у пациентов с генотипом Gln/Gln (. В целом, представленные в мировой литературе сведения по этому вопросу противоречивы, что свидетельствует о недостаточном знании всех механизмов функционирования гена XRCC1, с одной стороны, и может быть обусловлено также использованием различных сочетаний цитостатиков, с другой [21].

Поскольку гены ТР53 и XRCC1 функционально взаимодействуют, мы сочли целесообразным оценить взаимосвязь сочетаний генотипов с эффективностью НАХТ у больных НМРЛ. В частности, сочетанное носительство генотипов Arg/Trp 194 кодона и Arg/Arg 399 кодона гена

XRCC1 значительно увеличивает чувствительность НМРЛ к НАХТ по схемам, включающим цисплатин или карбоплатин [25]. Установлено, что сочетанное носительство генотипов, содержащих один и более вариантный аллель генов ТР53 4 экзона и ТР73 2 экзона, ассоциировано с повышенной чувствительностью НМРЛ к НАХТ препаратами платины [28]. Однако нами не получено данных, свидетельствующих о влиянии сочетаний полиморфных генотипов изучаемых генов на эффективность НАХТ у больных НМРЛ.

Данные по изучению влияния полиморфизма генов апоптоза и репарации на эффективность проводимой НАХТ у больных РМЖ представлены в табл. 3. В связи с небольшим числом пациентов, имевших полную регрессию и прогрессирование, мы сформировали 2 группы больных: с наличием и отсутствием ответа опухоли на проведение НАХТ, объединив в первую группу пациентов с полной и частичной регрессией, во вторую – со стабилизацией и прогрессированием процесса.

В настоящем исследовании не выявлено ассоциации полиморфизма гена TP53 с эффективностью НАХТ при анализе общей выборки больных РМЖ. При стратификации групп по клинико-морфологическим особенностям установлено, что при РМЖ с размером опухоли, соответствующей Т_3–4, частичная регрессия опухоли ассоциирована с Arg/Arg генотипом, который несут 58 % пациентов, тогда как в группе со стабилизацией процесса было 20 % носителей этого генотипа, при этом у носителей хотя бы одного аллеля Pro в 80 % случаев наблюдалась стабилизация либо прогрессирование (OR=5,60; CI95%=1,04–33,84, р=0,043). Полученные нами результаты согласуются с данными Xu et al. [27], которыми установлено, что Pro/Pro генотип гена TP53 ассоциирован с невосприимчивостью РМЖ к НАХТ по схемам, содержащим антрациклины. Мы не выявили взаимосвязи сочетаний генотипов генов ТР53 (экзон 4) и XRCC1 с эффективностью НАХТ среди больных РМЖ (табл. 3).

Представленные в статье данные являются оригинальными для популяции Западной Сибири. Недавно было проведено исследование взаимосвязи полиморфизма генов цитохромов суперсемейства P4502С, которые участвуют в биотрансформации химиопрепаратов, с эффективностью неоадъювантной химиотерапии у больных РМЖ из этого региона [9]. При этом было выявлено, что ни один из мутантных аллелей CYP2C8*2, CYP2C8*3, CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2 не является фактором, определяющим эффективность проводимой неоадъювантной химиотерапии у больных раком молочной железы.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии ассоциаций отдельных генотипов гена TP53 и гена репарации ДНК XRCC1 с эффективностью неоадъювантной химиотерапии у больных НМРЛ и РМЖ. Наряду с литературными данными это указывает на целесообразность дальнейших исследований по выявлению дополнительных маркеров, позволяющих предсказывать эффективность НАХТ. При этом обязательно следует учитывать схему химиотерапии (комбинации химиопрепаратов). Возможным резервом для повышения информативности анализа является использование сочетаний полиморфизмов генов, для которых в литературе представлены данные о предсказательной значимости на реплицирующих выборках, а также учет соматического статуса гена TP53, который может влиять на способность клеток опухоли к апоптозу.