Влияние полиморфизма генов CYP2C9 и VKORC1 на безопасность терапии варфарином

Варфарин – самый используемый в мире имущества перед другими кумаринами заклю-непрямой антикоагулянт. Его основные пре- чаются в более высокой прогнозируемости те- рапевтического действия, быстром начале действия и относительно быстром прекращении действия при снижении дозы или отмене препарата.

Механизм действия варфарина основан на ингибировании витамин-K-редуктазы и вита-мин-K-эпоксидредуктазы. В результате в печени образуются частично декарбоксилированные, иммунологически определяемые, но биологически неактивные факторы свертывания [1-5].

Доза варфарина, стабильность его антикоагулянтного эффекта и риск кровотечений зависят от пола, возраста, сопутствующих заболеваний, количества витамина K в пище, приема лекарственных препаратов и генетических особенностей. Не так давно стало ясно, что индивидуальную чувствительность к лекарственному средству во многом формирует наследственная предрасположенность [6]. Предполагается, что генетическая вариабельность обеспечивает до 30-40% различий в действии препарата.

В настоящее время найдено более 30 генов, которые кодируют белки, оказывающие влияние на действие варфарина. Обнаружено около тысячи однонуклеотидных полиморфных маркеров этих генов.

Наибольший вклад в вариабельность действия варфарина дает полиморфизм гена цитохрома P450 IIC9 ( CYP2C9 ) и гена субъединицы 1 витамин-K-эпоксидредуктазы ( VKORC1 ) [6, 7].

S-варфарин метаболизируется в печени ци-тохромомом P450 IIC9 ( CYP2C9 ) с образованием 6-гидроксиварфарина и 7-гидроксивар-фарина, которые выводятся с желчью.

Полиморфизм генов изоферментов цитохрома P450 имеет ярко выраженную этническую специфичность. Различия в действии препаратов, регистрируемые в различных этнических группах – широко известный и мало изученный факт. В последние годы появилось все больше оснований для пристального изучения таких различий, поскольку в абсолютном большинстве случаев (по крайней мере, в нашей стране) эти данные не учитываются при разработке рекомендаций.

У гомозиготных носителей нормального аллеля CYP2C9*1 метаболизм и элиминация S-варфарина не нарушены. Наиболее изучены два полиморфных маркера гена CYP2C9, приводящих к значительному снижению скорости гидроксилирования варфарина – Arg144Cys (аллель CYP2C9*2) и Ile359Leu (аллель CYP2C9*3) [8, 9]. Носительство всех вышеперечисленных аллелей приводит к снижению скорости гидроксилирования варфарина, и, соответственно, к снижению его дозировки [10, 11].

Ген, кодирующий витамин-K-эпоксидредук-тазу ( VKORC1 ), был открыт в 2004 г. [12, 13]. Исследование полиморфизма этого гена выявило его выраженное влияние на чувствительность к непрямым антикоагулянтам.

Изучен и описан целый ряд полиморфных маркеров гена VKORC1 [14-19], при этом большинство замен локализовано в нетранслируе-мых областях. При исследовании последовательности гена VKORC1 у 11 больных, которым было достаточно низкой дозы (< 1,5 мг/сут), и 5 больных, которым требовалась высокая доза (> 6 мг/сут), выявлен промоторный полиморфизм G(-1639)A . Было показано, что активность промотора, содержащего аллель -1639G , на 44% выше, чем активность промотора с аллелем А. Активация транскрипции гена VKORC1 приводит к увеличению синтеза витамин-K-эпоксидредуктазы и, соответственно, к развитию резистентности к варфарину [20].

Обнаружена выраженная ассоциация этого полиморфного маркера гена VKORC1 с наличием резистентности или сверхчувствительности к варфарину. Например, больные с высокой чувствительностью к варфарину в 93% случаев оказались носителями аллеля -1639A . А среди больных с резистентностью к варфарину 86% были гомозиготными носителями аллеля -1639G. Частоты встречаемости этих аллелей в трех этнических группах (белые, негры, азиаты) коррелируют с межрасовыми различиями в дозах варфарина [21]. Высокая встречаемость аллеля -1639A у китайцев и малайцев приводит к широкой распространенности сверхчувствительности к варфарину в этих этнических группах. Напротив, аллель -1639A крайне редок у представителей негроидной расы, в связи с чем им чаще требуются высокие поддерживающие дозы варфарина [22].

Главная задача всех перечисленных исследований – попытка вычисления индивидуальной дозы варфарина, и в большинстве работ получены сходные результаты – гены VKORC1 и CYP2C9 в сочетании с фенотипическими факторами определяют 50-60% вариабельности дозы варфарина [7, 23]. На основании метаанализа многочисленных работ, посвященных фармакокинетике и фармакодинамике варфа-рина, принято считать, что определение полиморфных маркеров генов CYP2C9 и VKORC1

может быть оправдано перед началом терапии варфарином и может существенно снизить риски такой терапии, однако существуют и противоположные точки зрения [24], и на сегодняшний день не получено окончательного ответа на вопрос о целесообразности использования генетических тестов для определения дозы варфарина, особенно для российской популяции, где большая часть исследований проводилась на выборках, не превышающих нескольких десятков человек.

В настоящей работе была поставлена задача изучить распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов CYP2C9 и VKORC1 у русских больных, проживающих в г. Москве, и оценить влияние генетических факторов на терапию варфарина.

Материал и методы. В исследование было включено 400 больных (247 мужчин и 153 женщины), госпитализированных в кардиологические стационары г. Москвы. Средний возраст составил 62,2±4,9 лет, среди обследованных мерцание предсердий зарегистрировано у 348 (87%) больных, трепетание предсердий – у 52 (13%).

В исследование не включались больные с вторичной мерцательной аритмией (МА,) у 8 больных (1,8%) МА была расценена как идиопатическая. У подавляющего большинства больных – 296 (74%), наблюдалась тахисисто-лическая форма МА. У 260 (65%) больных данное нарушение ритма было выявлено впервые. У 140 (35%) больных эпизод мерцательной аритмии был очередным, из них у 124 (31%) рецидивы МА были раз в месяц и чаще. Средняя длительность настоящего периода МА составила 137,3 + 36,30 дней. У 80 больных определить длительность периода МА не удалось. У 96 (24%) больных МА была выявлена случайно, при посещении врача по другому (не кардиологическому) поводу. Остальные пациенты имели симптомы аритмии, или признаки сердечной недостаточности (СН), которые и послужили причиной обращения к врачу.

Избыточная масса тела (ИМТ более 25 кг/м2) отмечалась у 300 (75%) больных. 76 (19%) больных курили на момент обследования, у 148 человек (37%) курение отмечено в анамнезе.

В исследование не включались пациенты с некомпенсированным гипо- или гипертиреозом (по результатам анализа крови на ТТГ, Т4 и Т3). Среди обследованных было 32 человека (8%) с заболеваниями щитовидной железы – 13 больных с узловым зобом и 4 – с тиреоидитом. На момент обследования у всех больных был достигнут эутиреоз.

Из клинических факторов риска тромбоэмболических осложнений у включенных в исследование отмечены следующие: большинство страдали артериальной гипертензией — 364 (91%), 144 (36%) больных имели ИБС в анамнезе, 15 (3,7%) – инфаркт миокарда, 17 (4,2%) пациентов страдали облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей. 40 человек (9,8%) были старше 75 лет. Признаки сердечной недостаточности наблюдались у 276 (69%) больных, из них почти у трети (27%) на момент обследования класс по NYHA был III и более. Из числа обследованных больных инсульт в анамнезе имели 15 (3,7%), сахарный диабет – 68 (17%). Индекс CHA 2 DS 2 -VASc ≥ 2 отмечался у 340 (85%) больных, больные с индексом CHA₂DS₂-VASc=0 в исследование не включались. Распределение по значению индекса CHA₂DS₂-VASc оказалось следующим: 1 балл – 60 (15%) пациентов, 2 балла – 264 (66%) пациента, 3 балла – 64 (16%) пациента, 4 балла – 8 (1,9%) пациентов, 5 баллов – 4 (0,9%) пациента.

На основании клинических и лабораторных (гематологический и биохимический анализы крови, коагулограмма) параметров рассчитывалось значение индекса HAS-BLED. Значение индекса HAS-BLED ≥ 3 (высокий геморрагический риск) выявлено у 52 (13%) больных.

До включения в исследование почти треть больных (28%) не получали терапию по поводу сердечно-сосудистых заболеваний. Среди остальных больных только 25% получали антиаг-реганты (аспирин в суточной дозе 75-125 мг). До включения в исследование антикоагулянты никто из обследованных больных не получал. Всем пациентам проводился подбор поддерживающей дозы варфарина (целевое МНО 2,03,0). Диапазон поддерживающих доз варфарина варьировал от 1,25 мг до 15 мг. Эпизоды избыточной гипокоагуляции (МНО >3) в период подбора дозы варфарина отмечались у 26% больных. Тяжелых кровотечений не отмечалось, частота не тяжелых кровотечений в период подбора дозы варфарина составила 8,4% (18 случаев: 5 – макрогематурия, 7 – носовые кровотечения, 4 – кровоточащий геморрой, 2 – множественные спонтанные подкожные гематомы).

Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом- хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [25].

Амплификацию полиморфных участков исследуемых генов проводили с помощью ПЦР «в реальном времени» на термоциклере «ABI StepOnePlus» (Applied Biosystems) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 16.6 мМ сульфат аммония, 0.01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 250 нМ флуоресцентных зондов, 1.5 ед. Taq ДНК-по- лимеразы (термостабильная ДНК-полимераза Taq производства ЗАО «Евроген», г. Москва, олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген», г. Москва, флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез», г. Москва), 50-100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагментов ДНК: 950C/2 мин – 1-й цикл; 940C/10 сек, 54-660C/60 – 40 циклов, условия ПЦР, последовательности праймеров, флуоресцентных зондов и метод детекции генотипов для исследованных локусов приведены в табл. 1.

Таблица 1

Последовательности праймеров, флуоресцентных зондов и особенности амплификации полиморфных участков генов CYP2C9, VKORC1

Ген	Полиморфный маркер	Метод генотипирования	Последовательность праймеров, 5`-3`	Последовательность зондов, 5`-3`	Температура отжига, 0 С
CYP2C9	rs1799853	TaqMan	cctgttaggaattgttttca cacccttggtttttctca	cattgaggacCgtgttcaag cattgaggacTgtgttcaag	58
	rs1057910	TaqMan	ccaggaagagattgaacg gggaatgagatagtttctga	tccagagatacAttgaccttct tccagagatacCttgaccttct	58
VKORC1	rs9923231	TaqMan	ctaggattataggcgtgag ggaagtcaagcaagagaa	cgcaccCggccaat cgcaccTggccaat	60

Используемые в зондах флуоресцентные красители – FAM (карбоксифлуоресцеин) и HEX (гексахлорофлуоресцеин), тушитель флуоресценции – BHQ-1, в последовательности зонда позиция полиморфизма синтезирована с применением модификации LNA (locked nucleic acid).

Обозначения полиморфных маркеров даны в соответствии с базой данных dbSNP .

Статистический анализ распределения частот генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат ( χ ² ). Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях "случай-контроль"» [26] и пакета статистических программ SPSS версии 17.

Результаты и обсуждение

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров генов VKORC1 и CYP2C9 в группе пациентов соответствовало распределению Харди-Вайнберга, что говорит об отсутствии ошибок в формировании выборки и при гено- типировании. Cущественных отличий от частот аллелей и генотипов в европейской популяции обнаружено не было (табл. 2-4).

Дозировка варфарина, необходимая для достижения целевых значений МНО, различалась у носителей различных генотипов полиморфных маркеров гена CYP2C9 (табл. 5), при этом, наибольшая средняя доза требовалась для носителей генотипа *1/*1 , а наименьшая – для носителей аллелей *2 и *3 . Статистически значимые различия были обнаружены между группами пациентов с генотипами *1/*1 и носителями других вариантов, в то время как при сравнении групп носителей *2 и *3 уровень значимости был больше 0,05 из-за малого количества пациентов с такими генотипами.

В большом числе работ установлено, что носители аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 нуждаются в более низких суточных дозах варфарина [11, 27-31]. Например, у больных, получавших низкую дозу варфарина (10,5 мг/нед), частота выявления аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 была в 6 раз выше, чем у получавших среднюю дозу [11]. Установлено, что у носителей аллелей

CYP2C9*2 и CYP2C9*3 существенно снижен клиренс S-варфарина (клиренс R-варфарина не различался) [32].

По результатам мета-анализа 9 исследований установлено, что носительство аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 приводит к снижению суточной дозы варфарина на 17 и 37% соответственно. Полиморфизм CYP2C9 приводит к 2-

3-кратному увеличению риска кровотечений в период подбора дозы варфарина [33, 34], но не повышает риск кровотечений при поддерживающей терапии [35]. Это наблюдение свидетельствует в пользу того, что фармакогенетические данные важны для подбора дозы варфарина и не имеют существенного значения в последующем периоде лечения.

Таблица 2

Сравнение частот генотипов полиморфного маркера Arg144Cys гена CYP2C9 в обследованной выборке с рассчитанными по равновесию Харди-Вайнберга (тест хи-квадрат, df = 1)

Генотипы	Случаи	HWE	χ 2	р
	n = 400	n = 400
Генотип Arg/Arg	329/0,823	326/0,814	0,36	0,55
Генотип Arg/Cys	64/0,159	70/0,176
Генотип Cys/Cys	7/0,018	4/0,01

Таблица 3

Сравнение частот генотипов полиморфного маркера Ile359Leu гена CYP2C9 в обследованной выборке с рассчитанными по равновесию Харди-Вайнберга (тест хи-квадрат, df = 1)

Генотипы	Случаи	HWE	χ 2	р
	n = 400	n = 400
Генотип Ile/Ile	363/0,908	359/0,899	2,306	0,13
Генотип Ile/Leu	32/0,081	40/0,099
Генотип Leu/Leu	5/0,012	1/0,003

Таблица 4

Сравнение частот генотипов полиморфного маркера G(-1639)A гена VKORC1 в обследованной выборке с рассчитанными по равновесию Харди-Вайнберга (тест хи-квадрат, df = 1)

Генотипы	Случаи	HWE	χ 2	р
	n = 400	n = 400
Генотип GG	148/0,369	152/0,38	0,21	0,64
Генотип GA	197/0,494	189/0,473
Генотип AA	55/0,137	59/0,147

Для полиморфного маркера G(-1639)A гена VKORC1 дозировка варфарина, необходимая для достижения целевых значений МНО, различалась у носителей различных генотипов, наибольшая средняя доза требовалась носителям генотипа GG, а наименьшая – носителям генотипа AA, между группами носителей генотипа GG и генотипов GA и AA были обнаруже- ны статистически значимые различия (табл. 6).

Для исключения возможного влияния генотипов полиморфных маркеров гена CYP2C9 отдельно была проанализирована группа носителей генотипа *1*/1, в которой дозы варфари-на оказались выше, но соотношение между генотипами маркера G(-1639)A гена VKORC1 не изменилось (данные не показаны).

Таблица 5

Генотипы	Доза варфарина, мг/сут	Уровень значимости
Генотип *1/*1	5,20±1,68	p = 0,023
Генотип *1/*2	3,84±1,79	p > 0,05
Генотип *1/*3	3,78±1,83	p > 0,05
Генотип *2/*3	3,32±1,19	p > 0,05
Генотип *2/*2	3,23±1,41	p > 0,05
Генотип *3/*3	3,29±1,22	p > 0,05

Таблица 6

Генотипы	Доза варфарина, мг/сут	Уровень значимости
Генотип GG	5,62±1,12	p = 0,015
Генотип GA	4,31±1,92	p > 0,05
Генотип AA	4,06±1,79	p > 0,05

Зависимость поддерживающей дозы варфарина от генотипов полиморфных маркеров гена CYP2C9

Зависимость поддерживающей дозы варфарина от генотипов полиморфного маркера G(-1639)A гена VKORC1

Полученные нами результаты подтверждают более ранние данные отечественных авторов на малых выборках и позволят разработать более точный алгоритм выбора начальной дозы вар-фарина, в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов CYP2C9 и VKORC1.