Влияние посевной культуры на рост микробных популяций в суспензионных условиях биореакторных системах

Эффективность выращивания микроорганизмов глубинносуспензионным методом определяется не только видом использованного штамма, физико-химическими условиями и составом питательных сред, а также качеством посевного материала / инокулята / - а) адаптация культуры к условиям и составу питательной среды, б) возрастом, в) концентрацией микробных клеток посевного материала, г) способом культивирования: периодическим или непрерывным.

Для установления зависимости роста культуры бруцелл от качества посевного материала провели сравнительные исследования при периодическом 30-тичасовом глубинно - суспензионном методе культивирования бруцелл штамма 82 в гидролизатлактальбуминовой среде (ГЛА) биореакторных системах (СФЛ – И), где для засева использовали инокулят, полученный на различных питательных средах: 1) 48-часовая культура бруцелл, выращенная на печеночно-пептон-глюкозо-глицериновом агаре (ППГГА). 2) 12-тичасовая культура бруцелл, полученная в ГЛА среде. Результаты представлены таблице 1.

1. Зависимость роста культуры бруцелл от качества посевного материала

Вид инокулята	Параметры роста
	Х мах млрд.м.к.	-1 М мах час
48 – часовая культура бруцелл с ППГГА среды	34	0,16
12 – часовая культура бруцелл ГЛА среды	37	0,17

Результаты исследований показали, что культура бруцелл адаптированная к различным условиям культивирования и полученная на различных питательных средах для использования в качестве посевного материала способствует росту культуры и повышает продуктивность бруцелл, что выражается показателями: концентрацией целевого продукта – биомассы и максимальной удельной скоростью роста культуры, где рост численности микроорганизмов происходит с максимальной удельной скоростью М мах по экспоненциальному закону, т.е. в этой фазе численность микробных клеток возрастает с постоянной скоростью, имея линейную зависимость от времени.

Дальнейшей задачей являлось установление оптимального возраста посевного материала для получения физиологически зрелой и иммунологически активной культуры. В исследованиях использовали инокулят четырех возрастов – 6, 12, 18, 24 часов. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Экспериментально установлено, что возраст инокулята от 6 до 12 часов является оптимальным по параметрам роста культуры бруцелл в суспензионных условиях, что подтверждает количественный рост концентрации микробных клеток (36–37 млрд.м.к./ мл), где величина

Ммах, являясь характеристикой конкретных условий роста культуры, представляет собой одну из наиболее важных кинетических постоянных, где основная зависимость выражается образованием биомассы.

2. Зависимость параметров роста культуры бруцелл от возраста инокулята

Параметры роста Культуры	Возраст инокулята
	6	12	18	24
Хмах млрд. м.к./мл	36	37	33	31
-1 Ммах час	0,17	0,17	0,15	0,14

При выращивании периодической или непрерывной культуры существенная роль отводится начальной посевной концетрации микробных клеток, потому что при малых концентрациях рост микроорганизмов может вообще не начаться или проходить очень длительное время. Для установления оптимальной концентрации использовали посевной материал культуры бруцелл следующих значений: 0,5, 2,0, 3,5, 5,0 млрд. м.к./мл. Результаты исследований представлены в таблице 3.

3. Влияние посевной концентрации бруцелл на параметры их роста

Параметры роста культуры	Хо млрд. м.к./ мл
	0,5	2,0	3,5	5,0
Хмах млрд. м.к./мл	26	37	39	41
-1 Ммах час	0,13	0,17	0,17	0,18
% жизнеспособности	100	96	84	78

Примечание: Хо млрд. м.к - посевная концентрация микробных клеток;

Хмах млрд. м.к. – максимальная концентрация микробных клеток;

Ммах/ час-1 – максимальная удельная скорость роста микробных клеток;

Максимальная концентрация бактериальной массы / 41 млрд. м.к./ наблюдалась при начальном засеве Хо – 5 млрд. м.к. и последовательно снижалась с уменьшением посевной дозы бруцелл. Максимальная удельная скорость роста оставалась практически одинаковой для всех случаев, а жизнеспособность микробных клеток уменьшалась до 78% с увеличением посевной дозы, что связано с ростом числа нежизнеспособных микробных клеток при повышении их концентрации и накоплением ингибирующих рост метаболитов в суспензионной жидкости. Таким образом, проведенные исследования показали, что целесообразно использовать экспериментально установленную дозу посевного материала (инокулята) – 2 млрд. м.к./мл, где жизнеспособность микробных клеток в процессе микробного синтеза находится на уровне 96%.

Полученный непрерывным методом инокулят имеет ряд преимуществ перед периодическим способом, что выражается отличительными характеристиками получения посевного материала при выращивании в суспензионных условиях. Во первых, непрерывный процесс проточного культивирования микроорганизмов можно поддерживать длительное время, во вторых, микробные клетки находятся в более благоприятных условиях с точки зрения их физиологического состояния, потому - что непрерывное обновление (разбавление) питательной среды в биореакторных системах позволяет избегать таких присущих периодическому процессу явлений, как постепенное исчерпывание лимитирующего субстрата и накопление в питательной среде метаболитов – ингибиторов роста микробных клеток. Возможность появления нерегулируемых лимитирующих и ингибирующих факторов может оказать влияние как на параметры роста, так и на качественный состав конечного продукта. В-третьих, посевной материал, полученный и используемый в качестве инокулята из экспоненциальной фазы роста, имеет более однородный состав микробных клеток и высокую физиологическую и иммунологическую активность. Схема получения как посевного материала, так и целевого продукта, осуществлялась в следующей последовательности: подготовленный реактор ферментатора (СФЛ - И) заполняли 2,5 – 3,0 л питательной средой (ГЛА), вносили культуру бруцелл штамма 82 из расчета 2 млрд. м.к./мл и культивировали в периодическом режиме в течение 24 - 30 часов при постоянной подаче кислорода 2 л/мин и перемешивании культурально - суспензионной жидкости 400 об/мин. Затем переводили на процесс непрерывного культивирования при непрерывной подаче с постоянной скоростью свежей среды и одновременным отводом (отбором) с той же скоростью суспензионной жидкости, содержащей бактериальные клетки и продукты их метаболизма; при этом общий объем культуры оставался постоянным. Для подтверждения этой зависимости, провели серию опытов экспериментального характера, где использовали непрерывную подачу питательной среды в биореактор со средней скоростью – 100, 200, 300, 400 мл/час, что соответствовало скорости разбавления Д = 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 час-1. В таблице 4 представлены показатели роста непрерывной культуры с учетом постоянной подпитки и установления значений оптимальной скорости разбавления для получения стационарной концентрации биомассы с высокой жизнеспособностью микробных клеток.

Полученные результаты свидетельствуют, что высокая стационарная концентрация бруцелл отмечалась при скорости разбавления Д = 0,15 - 0,2 час-1. Им же соответствовал значительный процент жизнеспособных клеток – 96 – 98%. Из чего следует, что стационарная концентрация биомассы линейно зависит от концентрации вводимого в ферментер раствора субстрата, где рост культуры в режиме хемостата характеризуется критической скоростью разбавления, выше которой не наблюдается роста популяции, так как при скоростях разбавления, соизмеримых с максимальной скоростью роста микроорганизма, культура вымывается из ферментера. При скорости разбавления 0,05–0,1 час-1 происходит исчерпание лимитирующего субстрата, рост культуры приостанавливается, что приводит биохимические механизмы регуляции роста биомассы и синтеза микробных метаболитов, основанных на ключевых ферментных процессах – к инактивации клеточных ферментных систем.

4. Результаты роста непрерывной – хемостатной культуры бруцелл шт. 82 в зависимости от скорости разбавления питательной среды

Параметры роста культуры	Скорость разбавления среды (Д – час-1)
	0,05	0,1	0,15	0,2
Х мах млрд. м.к./ мл	34	36	39	42
% жизнеспособности	71	86	96	98

Таким образом, установлено, что наиболее эффективный рост бруцелл шт. 82 наблюдается при использовании 6–12–часовой периодической и непрерывной культуры ( инокулята ), адаптированной к суспензионным условиям, при концентрации посадочно-посевного материала 2,0 млрд. м.к./ мл и непрерывной подачи свежей среды с постоянной скоростью разбавления и отбора образовавшихся продуктов хемостатной культуры - 0,15 – 0,2 час-1 и максимальной концентрацией 39 – 42 млрд. м.к./мл.

ЛИТЕРАТУРА:  1. Варфоломеев С.Д. Кинетические основы микробиологический процессов//М.: Высш.шк.- 1990.-296 с. 2. Грубер И.М. Кинетика процессов периодического культивирования Streptococcus pneumonede в зависимости от физиологического состояния посевной культуры//ЖМЭИ,-1986.- №2.-С.3-8.  3. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов//М.,1987.-279 с. 4. Иерусалимский Н.Д. Принципы регулирования скорости роста микроорганизмов//Управляемый биосинтез,- 1966.-С.5-19. 5. Печуркин Н.С. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций//Новосибирск: Наука,-1975.-215 с. 6. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток//М.: Мир.,1978.-331 с. 7. Работнова И.Л. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов//М.: Наука,-1979.-207 с.

ВЛИЯНИЕ ПОСЕВНОЙ КУЛЬТУРЫ НА РОСТ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ В СУСПЕНЗИОННЫХ УСЛОВИЯХ БИОРЕАКТОРНЫХ СИСТЕМАХ

Акимов Е.К., Галиуллин А.К.

Резюме

Установлено, что наиболее эффективный рост бруцелл шт. 82

наблюдается при использовании 6–12–часовой периодической и непрерывной культуры (инокулята), адаптированной к суспензионным условиям.

THE INFLUENCE OF INNOCULATIVE CULTURE ON THE GROWTH OF MICROBIAL POPULATIONS IN THE SUSPENSION CONDITIONS OF BIOREACTIVE SYSTEMS

Akimov Ye.K., Galiullin, A.K.