Влияние пробиотической бактерии Bacillus subtilis на поведенческие характеристики мышей и биохимические показатели сыворотки крови при индуцированном системном воспалении

В последние годы пробиотики активно исследуются как перспективные средства для модуляции иммунного ответа и снижения воспалительных реакций [1]. Среди них особый интерес представляют грамположительные бактерии Bacillus subtilis , демонстрирующие иммунорегуляторные свойства [2]. Их применение на фоне ЛПС – индуцированного воспаления представляет значительный интерес, поскольку липополисахарид (ЛПС) является ключевым патоген-ассоциированным молекулярным паттерном (РАМР), запускающим каскад провоспали-тельных реакций через активацию Toll-подобных рецепторов (ТRL4) [3].

Мыши ( Mus musculus ) являются моделью для воспалительных процессов, благодаря высокой степени схожести иммунных механизмов с человеческими [4].

Bacillus subtilis – спорообразующая бактерия, обладающая высокой устойчивостью к агрессивным условиям желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а также рядом пробиотических эффектов, включающих укрепление кишечного барьера, антимикробную активность, а также модуляцию иммунного ответа [5].

Липополисахарид (ЛПС) – основной компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий, который при системном введении вызывает мощный иммунный ответ, имитирующий хроническое воспаление [6]. У мышей ЛПС активирует TLR-4-зависимые сигнальные пути, приводя к выбросу провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-a) и инфильтрации иммунных клеток в ткани [7].

В данной работе оценивалось влияние Bacillus subtilis на динамику ЛПС-индуцированного воспаления у мышей, основываясь на данных биохимического анализа крови.

Материалы и методы

Эксперимент проводился в течение 3 недель. Модельным объектом были выбраны самцы Mus musculus линии С57ВL/6 из питомника «Андреевка» (Московская обл. Россия). Животные содержались в стандартных условиях согласно ГОСТ 33215–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур» и получали порцию корма из расчета 5 г/мышь/день.

При постановке эксперимента мыши были разделены на 4 группы:

• 1.    «Контроль» – группа (n = 10), которая получала стандартную лабораторную диету и внутрибрюшинные инъекции 0,9 % раствора NaCl.

• 2.    «ЛПС – группа» (n = 10), получавшая стандартную лабораторную диету и инъекции ЛПС.

• 3.    «B. subtilis» – группа (n = 5), которая принимала пробиотик на основе B. subtilis (10⁹ КОЕ/грамм корма), вместе со стандартным рационом, и внутрибрюшинные инъекции 0,9 % раствора NaCl.

• 4.    «ЛПС + B. subtilis» – группа (n = 10), которая подверглась воздействию пробиотика на основе B. subtilis (10⁹ КОЕ/грамм корма), смешанного со стандартным рационом, и инъекциям ЛПС.

В качестве ЛПС был выбран препарат «Пирогенал» (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи», Россия) в концентрации 100 мкг/мл. Внутрибрюшинные инъекции объемом 200 мкл проводили ежедневно в течение последней недели эксперимента. Раствор для введения разводили 1:1 ЛПС с раствором 0,9 % NaCl [8].

Физиологический тест «Открытое поле» проводился перед началом эксперимента и в конце каждой недели. Установка для теста представляла собой квадратный короб 40 x 40, ограниченный непрозрачными бортами высотой 20 см. На дне было 5 случайно расположенных отверстий, моделирующих норки.

Время проведения теста 5 минут, в течение которых регистрировались следующие показатели: горизонтальная активность, вертикальная активность, норковый рефлекс. Также детектировалась вегетативная деятельность: дефекация, количество и продолжительность актов груминга.

Забор крови осуществлялся путем декапитации мышей, предварительно наркотизированных хлороформом, в пластиковые пробирки. Полученную кровь отстаивали 1 ч, затем надосадочную жидкость центрифугировали при 3500g 10 минут. Получившуюся сыворотку анализировали на автоматическом анализаторе «ВитаЛайн 200» (Vitaline 200, Россия).

Статистические манипуляции выполнялись в среде R (Version 4.1.1). Полученные данные в ходе анализа проверялись на нормальность распределения тестом Шапиро-Уилка. Однофакторный дисперсионный тест (ANOVA) и пост-хок тест Тьюки использовались для анализа нормально распределенных данных. Скорректированное p-значение ≤ 0,05 считалось статистически значимым результатом. Результаты представлены как средние значения ± стандартное отклонение (SD).

Результаты

В ходе исследования были изучены поведенческие и физиологические показатели экспериментальных животных с помощью теста Открытого поля и проведен анализ результатов (рисунок 1, 2).

В экспериментальной группе « B. subtilis » наблюдалось уменьшение актов груминга в 2,1 раза относительно контрольной группы (3,4 ± 0,17 против 1,6 ± 0,18, p = 0,048). В то же время, у животных, получавших только B. subtilis , было детектировано увеличение норкового рефлекса в 1,8 раз в сопоставлении с контролем (5,2 ± 0,3 против 2,9 ± 0,14 p = 0.01) (рисунок 1).

Также было выявлено статистически значимое снижение актов дефекации в 6 раз у представителей группы, подвергнувшимся исключительно инъекциям ЛПС, в сравнении с группой «Контроль» (0,4 ± 0,07 против 2,4 ± 0,14 p = 0,0009) (рисунок 1).

Груминг      Норка      Дефекация

Grooming       Mink       Defecation

Рисунок 1. Количественные показатели физиологического теста «Открытое поле», * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001

Figure 1. Quantitative indicators of the physiological test "Open field", * p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001

В группе животных, получавших только ЛПС, наблюдалось снижение в 1,7 раз вертикальной активности относительно контрольной группы (8 ± 0,45 против 13,8 ± 0,52, p = 0.02). Напротив, в связи с приемом пробиотика на основе B. subtilis выявлено увеличение в 1,5 раза исследовательского рефлекса, выраженного вертикальными стойками, в сравнении с группой «Контроль» (20,8 ± 1,3 против 13,8 ± 0,52 p = 0,04) (рисунок 2).

Рисунок 2. Количество вертикальных стоек, зафиксированных во время проведения физиологического теста «Открытое поле», *p ≤ 0,05

Figure 2. Number of vertical rearings recorded during the Open Field physiological test, * p ≤ 0.05

Также был проведен анализ данных биохимических показателей сыворотки крови. Выявлено статистически достоверное снижение содержания холестерина в группе «ЛПС» относительно группы «Контроль» (8,43 ± 0,44 против 6,20 ± 0,23, p = 0,0001). На ряду с этим наблюдалось и увеличение содержания мочевины у группы « B. subtilis » относительно контрольной группы (8,16 ± 1,00 против 12,95 ± 0,77, p = 0,02) (рисунок 3).

Холестерин Cholesterol

Мочевина Urea

Рисунок 3. Различия в биохимическом составе крови между исследуемыми группами, * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001 Figure 3. Differences in blood biochemistry between study groups, * p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001

Обсуждение

Анализ исследовательской активности в тесте «Открытое поле» показал достоверное увеличение количества заглядываний в норки. Это является важным поведенческим маркером когнитивной активности [9], что может свидетельствовать о способности B. subtilis увеличивать исследовательскую активность мышей [10].

Изменение актов дефекаций говорит о негативном воздействии липополисахарида на перистальтику кишечника и может свидетельствовать о проявление стресса у животных [11].

Исследование частоты вертикальной активности разных групп позволяет сделать предположение, что липополисахарид негативно воздействует на исследовательскую активность, а B. subtilis наоборот ее повышает, такой эффект ЛПС сходен с воздействием антибиотика [12].

Известно, что чрезмерный груминг у грызунов является стрессовым маркером [13], в то время как в экспериментальной группе B. subtilis наблюдалось уменьшение количества актов груминга, что соотносится с литературными данными о снижении тревожности при приеме пробиотиков и может свидетельствовать о анксиолитическом эффекте пробиотического штамма [14].

Снижение содержания холестерина может быть связано с активацией макрофагов, на фоне введения ЛПС. В свою очередь, они останавливают биосинтез холестерина с помощью активации фермента холестерин-25-гидроксилазой (СН25Н). Под действием СН25Н холестерин превращается в 25-гидроксихолестерин, который ингибирует синтез холестерина и стимулирует его выведение [15].

Прием B. subtilis способствует улучшению морфологии кишечника и его бактериального состава [16]. Также в литературных источниках описан фермент уреаза, продуцируемый данным видом бактерий. Однако он имеет низкую эффективность при гидролизе мочевины до аммиака и СО2 [17]. Результатом нашего исследования является увеличение уровня мочевины на фоне приема B. subtilis, что возможно косвенно связано с перестроением микробиома и требует дальнейшего исследования.

Заключение

Влияние ЛПС, индуцирующего воспаление, негативно отражается на поведенческих реакциях организма. Снижается исследовательская активность, ухудшается работа кишечника, в связи со структурными изменениями, вызванными инъекциями ЛПС. В свою очередь пробиотик на основе бактерий вида B. subtilis позитивно воздействует на исследовательский интерес животных и приводит к снижению уровня стресса. При этом выявленные эффекты демонстрируют двойственность действий B. subtilis : моделируя ось «кишечник-мозг» и снижая тревожность, он одновременно вызывает метаболические изменения. Однако наряду с этим B. subtilis увеличивает уровень мочевины в крови и не оказывает должного протекторного свойства на фоне приема ЛПС. Следовательно, требуется дальнейшее более глубокое изучение B. subtili на биохимические показатели крови, включая исследование механизмов взаимодействия пробиотиков с физиологией хозяина при воспалении, а также поиск пробиотика, способного нивелировать негативное воздействие ЛПС.

Перспективным направлением может стать разработка комплексным синбиотических препаратов для коррекции ЛПС-индуцированных нарушений.

Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект FZGW-2024–0003).