Влияние протеолитических ферментов на аминокислотный состав фильтрата и дробины зернового сусла, полученного из УДА-обработанной ржи

Вопросы, связанные с технологическими приемами, позволяющими получать зерновое сусло с новыми качественными показателями, на сегодняшний день остаются по-прежнему актуальными. Получение зернового сусла заключается в смешивании измельченного зернового сырья с водой с последующей водно-тепловой и ферментативной обработкой с целью максимального растворения сухих компонентов в растворе, что зависит от состава ферментативного комплекса и дозы внесения ферментов, входящих в их состав, а также от степени деструкции зерна. С увеличением удельной поверхности сырья увеличивается степень атакуемости компонентов зернового сырья ферментами [1–5].

К приемам измельчения зернового сырья, которые обеспечивают высокую удельную площадь помола, можно отнести следующие способы деструкции: экструзионная обработка, микронизация (облучение зерна в ИК-спектрах), ультразвуковая обработка замесов и другие.

Микронизация [6] заключается в облучении сырья ИК-излучением. Влага зерновки переходит в паровую фазу, и внутри полости возникает повышенное давление. За счет этих тепловых процессов происходит дезагрегация структуры компонентов сырья, что повышает их растворимость при получении сусла.

Экструзия – процесс, совмещающий высокоинтенсивную термо-, гидро- и механическую обработку сырья, что делает возможным получение сусла с высоким содержанием сухих веществ до 30–36% при снижении расходов на энергию и дозы внесения вспомогательных компонентов, таких, как ферментные препараты.

Но существуют данные, что применение таких жестких способов обработки, как экструзия или микронизация (обработка ИК-излучением) зернового сырья, приводит к снижению биологической ценности обработанного материла. В результате этого большинство аминокислот измельченного материала становятся лимитирующими, а общая сумма α-аминного азота снижается [7].

Еще одним перспективным способом глубокого измельчения зернового сырья является ударно-дезинтеграторно-активаторная (УДА-) обработка. Использование помолов, полученных путем обработки зерна на дезинтеграторе, для приготовления замесов обеспечивает более полное растворение компонентов сырья, реологические свойства получаемых гидролизатов меняются таким образом, что позволяют провести водно-тепловую обработку замесов при пониженных температура – до 60 °C, сократить время гидролиза крахмала до 1 ч и снизить дозы внесения ферментных препаратов [8].

Методом электронной микроскопии было показано, что протеиновые структуры УДА-обработанного зерна приобретают более рыхлую поверхность, увеличивается количество крахмала за счет их высвобождения из белковой матрицы.

Одномерным ДДС-Na – электрофорезом на гелевых пластинах было установлено, что применение дезинтеграторов для измельчения ржи позволяет произвести помол с большим содержанием следующих белковых фракций: глютелинов (116,25 кДа), глобулинов (60–75 кДа) и альбуминов (17–28 кДа), аминокислотный состав которых характеризуется набором незаменимых аминокислот в оптимальном соотношении. Увеличение в результате УДА-обработки водорастворимой альбуминовой фракции позволяет сделать заключение, что белковая фракция муки более интенсивно будет переходить в раствор, тем самым увеличивая доступность белков для дальнейшей технологической обработки, например, ферментными препаратами [9].

Методом капиллярной гель-проникающей хроматографии было показано, что при применении дезинтегратора для измельчения зерна образуется суммарно большее количество свободных аминокислот. Исходя из этого, можно предположить, что, несмотря на высокую интенсивность воздействия устройства на растительный материал, дезинтегратор обеспечивает деградацию высокомолекулярных природных полимеров (белков), не затрагивает при этом структуру мономерных единиц – аминокислот [10].

Таким образом, из зерновых помолов, полученных путем измельчения на УДА-установках можно получить сусло, обогащенное белково-аминокислотным составом, а дополнительное внесение ферментных препаратов протеолитического действия сможет обеспечить деструкцию белковых составляющих. Механизм ферментативного действия бактериальной протеазы заключается в гидролизе белков до более мелких фрагментов – пептидов, активность которых проявляется при слабокислом и нейтральном водородном показателе среды, а грибной – в гидролизе пептидной связи с концевой цепи с высвобождением свободных аминокислот. Активность грибной протеазы проявляется при кислом и слабокислом водородном показателе среды.

Сусло, полученное из УДА-обработанной ржи, можно разделить на две фракции: фильтрат и дробину. В литературе [6] есть данные, которые свидетельствуют, что применение протеаз позволяет эффективно разделять сусло, полученное из пшеницы и измельченное на фильтрат и дробину, с последующим применением этих фракций в различных технологических процессах: фильтрат – на спирт или получение сахаросодержащих продуктов (сиропы из цельного зерна), дробину – как кормовую добавку в рационе животных.

Исследований по влиянию УДА-обработки ржи с внесением ферментных препаратов протеолитического действия на аминокислотный состав фильтрата и дробины ранее не проводилось.

Цель работы – исследовать влияние ферментных препаратов протеолитического действия на аминокислотный состав фильтрата и дробины сусла, полученного из УДА-обработанной ржи.

Материалы и методы

В качестве исходного сырья использовали зерна ржи первого класса урожая 2017 года, с содержанием влаги 8%, условной крахмалистостью 53% и сорных примесей до 1%. Массовую долю влаги в зерне определяли на анализаторе влажности Shimadzu MOC-120Н. Определение условной крахмалистости зерна проводили поляриметрическим методом с применением концентрированной соляной кислоты на поляриметре марки РоlААr FF-55 фирмы Optikal Aktivity.

В опытах использовали помолы, полученные путем измельчения зерна ржи с различными рабочими органами. Исследуемые образцы помолов были приготовлены на дезинтеграторе ДЕЗИ-15 с трех- и пятирядными роторами. Контрольный образец был получен измельчением на лабораторной мельнице с роторноножевым рабочим органом. Полученные образцы помолов ржи исследовались с использованием лазерного дифракционного анализатора Malvern Mastersizer 2000. Средний интегральный размер частиц в помоле, полученном на дезинтеграторе c трехрядным ротором, составил 167,5 мкм, c пятирядным – 158,1 мкм, на мельнице с роторно-ножевым рабочим органом – 384,278 мкм.

В процессе водно-тепловой ферментативной обработки замеса последовательно вносили ферментные препараты термостабильной α-амилазы «АмилоЛюкс-АТС» и глюкоамилазы (γ-амилазы) «ГлюкоЛюкс-А», произведенные компанией ООО «ПО «Сиббиофарм»

(г. Бердск, Россия). В качестве источника протеолитических ферментов использовали препараты «Рrо100L» и «Протосубтилин ГЗх А-120». Препарат «Рrо100L» содержит кислую протеазу с активностью 600 ПС/г, получен путем культивирования микромицета рода Aspergillus sp. в соответствии со стандартом организации-изготовителя QB/Т1805.2–93. Препарат «Прото-субтилин ГЗх А-120» содержит нейтральную протеазу с активностью 120 ПС/г, получен путем культивирования бактериального штамма продуцента Bacillus subtilis согласно ТУ 9291-02913684916-2010. Протеолитические ферментные препараты вносились последовательно после стадии осахаривания сусла: сначала вносили бактериальный препарат «Протосубтилин ГЗх А-120» с дозой внесения 0,5 ед. ПС/г сырья; затем грибной препарат «Рrо100L» с дозой – 0,15 ед. ПС/г сырья. Дозу внесения ферментных препаратов рассчитывали согласно ТИ 1000334586-13-2016, ВНИИ ПБТ, г. Москва.

Замес с гидромодулем 1:3 нагревали на водяной бане LOIP LB-163 со скоростью нагрева 1 °C/мин с постоянным перемешиванием при температуре 60 °C с внесением ферментного препарата «АмилоЛюкс-АТС» дозой 0,3 ед. АС/гр. крахмала. Процесс гидролиза крахмала проводили в течение 1 ч. Для осахаривания разжиженной ржаной суспензии температуру образовавшейся массы снижали до 55 °C и вносили ферментный препарат «ГлюкоЛюкс-А» с дозой – 9,0 ед. ГлС/г крахмала. Процесс осахаривания проводили в течение 1,5 ч.

Определение содержания α-аминного азота (мг/дм3) производили колориметрическим методом с нингидрином.

Концентрацию аминокислот определяли с использованием аминокислотного анализатора KNAUER: просчет аминограмм осуществляли методом сравнения площадей стандарта и образца. Статистическую обработку данных, полученных в 3 повторностях, осуществляли с помощью программы Microsoft Excel с использованием коэффициента Стьюдента (доверительный интервал – 0,95).

Результаты и обсуждение

Данные по содержанию α-аминного азота в исследуемых образцах зернового сусла (мг/дм³) в зависимости от способа измельчения зерна и внесения протеолитических ферментных препаратов представлены на рисунке 1.

B – измельчение на дезинтеграторе с трехрядным ротором; C – измельчение на дезинтеграторе с пятирядным ротором и внесение протеолитических ферментных препаратов: 1 – содержание α-аминного азота в зерновом сусле без внесения протеолитических ферментных препаратов, мг/дм³; 2 – содержание α-аминного азота в зерновом сусле, в которое был внесен ферментный препарат «Протосубтилин ГЗх А-120» дозой 0,5 ед. ПС/г сырья, мг/дм³; 3 – содержание α-аминного азота в зерновом сусле, в которое были внесены ферментные препараты «Протосубтилин ГЗх А-120» дозой 0,5 ед. ПС/г сырья и «РRО100L» 0,15 ед. ПС/г сырья, мг/дм³

Figure 1. The content of α-amino nitrogen in samples of grain wort (mg/dm3), depending on the method of grinding grain: A – grinding on a laboratory mill with a rotary knife working body; B – grinding on a disintegrator with a three-row rotor; C – grinding disintegrator with a five-row rotor and making proteolytic enzyme preparations: 1 – content of α-amino nitrogen in grain wort without the addition of proteolytic enzyme preparations, mg/dm3; 2 – content of α-amino nitrogen in the grain wort, in which the enzyme preparation “Protosubtilin GZх A-120” was introduced with a dose of 0.5 units PS/g raw materials, mg/dm3; 3 – content of α-amino nitrogen in the grain wort, in which the enzyme preparations “Protosubtilin GZх A-120” were introduced with a dose of 0.5 units PS/g raw materials and "РRО100L" dose – 0.15 units. PS/g raw materials, mg-dm3

Наименьшее содержание α-аминного азота наблюдается в образах зернового сусла без внесения протеолитических ферментных препаратов. В образцах зернового сусла, которые были получены внесением ферментного препарата «Протосубтилин ГЗх А-120», количество α-аминного азота повысилось в 2–3 раза по сравнению с образцами сусла, полученными без внесения протеаз в препаративном виде. Последовательное внесение в замес бактериальной протеазы «Протосубтилин ГЗх А-120» и грибной протеазы «РRО100L» привело к увеличению содержания α-аминного азота в 3,6 раза по сравнению с образцами сусла, полученными без внесения протеаз, и 1,5 раза по сравнению с образцами сусла, полученными внесением только бактериальной протеазы «Протосубтилин ГЗх А-120». Таким образом, максимальное обогащение зернового сусла α-аминным азотом можно обеспечить совместным последовательным внесением бактериальной и грибной протеазы.

При анализе данных по содержанию α-аминного азота в образцах зернового сусла в зависимости от способа измельчения зерна было установлено, что самое низкое количество α-аминного азота содержится в сусле из помола, полученного измельчением на лабораторной мельнице с роторно-ножевым рабочим органом (контрольный образец). Содержание α-аминного азота в сусле, приготовленном из помола ржи, измельченной на дезинтеграторе с трехрядным ротором, выше примерно в 3 раза, чем в контрольном образце. Содержание α-аминного азота в сусле, приготовленном из помола ржи, измельченной на дезинтеграторе с пятирядным ротором, выше примерно в 2 раза, чем в образце, приготовленном из помола ржи, измельченной на трехрядном роторе, и в 6 раз выше, чем в контрольном образце. Полученные результаты свидетельствуют о том, что высокоинтенсивное измельчение зерна УДА-способом позволяет более глубоко разрушить белковую матрицу зерна.

В таблице 1 показано содержание свободных аминокислот (мг/г) в фильтрате и дробине, которые были получены центрифугированием сусла, приготовленного из помола ржи, измельченной на дезинтеграторе с пятирядным ротором, с внесением ферментных препаратов Прото-субтилин ГЗх А-120 дозой внесения протеазы – 0,5 ед. ПС/г сырья и РRО100L дозой внесения протеазы – 0,15 ед. ПС/г сырья.

Таблица 1.

Содержание свободных аминокислот в фильтрате и дробине

Table 1.

Content of free amino acids in filtrate and grains

Аминокислота Amino-acid	Содержание свободных аминокислот, мг/г Content of free amino acids, mg/g
	Дробина Grain	Фильтрат Filtrate
Аспарагиновая кислота Aspartic acid	0,34	0,34
Серин | Serine	0,39	0,37
Треонин | Threonine	1,57	1,61
Глутаминовая кислота | Glutamic acid	0,67	0,83
Пролин | Proline	1,30	1,61
Глицин | Glycine	0,17	0,16
Аланин | Alanine	0,51	0,38
Валин | Valine	0,36	0,38
Метионин | Methionine	0,19	0,19
Изолейцин | Isoleucine	0,37	0,36
Лейцин | Leucine	0,87	0,83
Тирозин | Tyrosine	0,27	0,30
Фенилаланин Phenylalanine	0,61	0,59
Гистидин | Histidine	0,59	0,56
Лизин | Lysine	0,49	0,41
Триптофан | Tryptophan	1,78	1,22
Аргинин | Arginine	0,76	0,68
Общее количество свободных (не связанных) аминокислот Total amount of free (unbound) amino acids	11,24	10,82