Влияние противоопухолевых препаратов на первичные культуры клеток больных колоректальным раком

Ежегодно в мире регистрируют примерно 600 000 новых случаев колоректального рака (КРР), около 300 000 человек умирают от этого заболевания [5]. В связи с тем, что большинство больных (до 70–80%) поступают в стационар на поздних стадиях развития заболевания, актуальным представляется совершенствование способов диагностики и схем лечения КРР [1, 2]. Расширение сферы применения методов молекулярной биологии в онкологии стимулирует трансформацию дескриптивного этапа развития этого раздела медицины, констатирующего биологические и клинические феномены, в аналитический этап углубленного изучения явлений с целью объяснения механизмов их возникновения. В свою очередь, расшифровка механизмов регуляции пролиферации опухолевых клеток, процессов метастазирования и ангиогенеза, особенностей репликации ДНК, развития и угнетения апоптоза – эти научные достижения последних десятилетий вносят существенный вклад в понимание генетических процессов клетки [4, 6].

Результаты патогенетических исследований стимулируют разработку новых подходов, в частности, генной и, так называемой, таргентной терапии неоплазий кишечника.

Цель исследования

Оценить in vitro влияние препаратов антиканцерогенного действия на опухолевые клетки при колоректальном раке.

Материалы и методы

Проведено исследование трансформированных и нетрансформированных клеток больных КРР. Биопсийный материал нормальной (на расстоянии 10 см от опухоли) и опухолевой эпителиальной ткани, отобранный во время операции 10 больных КРР, использовали для получения первичых неперевиваемых культур клеток. Получение первичных культур клеток. Образцы ткани подвергали механической и ферментативной дезагрегации на шейкере при 100 об/мин в течение 20 мин при 370С в среде культивирования МЕМ (Hyclone, Logan, UT) c добавлением 10% инактивированной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ЭС) и антибиотиков (пенициллин 100 Ед, цефазолин 5 Ед, канамицин 5 Ед на 1 мл среды), 15 мкг/мл ДНКазы I (Sigma, St. Louis, MO) [11]. Затем клетки центрифугировали 10 мин при 1 250 об/мин при 40С, помещали в 100 мм чашки для культивирования и инкубировали в термостате при 370С с 5% атмосферой СО 2 . Состав среды культивирования: 6,16 мл среды МЕМ; натрий фосфатный буфер 7,5%; 1,6 мл ЭС; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл раствора антибиотиков. Метод колоние-образования. Агаризованную 0,6% МЕМ среду объемом 20 мл с 1×105 клеток помещали в 100 мм чашки для культивирования, которые инкубировали в термостате при 370С в 5% атмосфере СО 2 в течение 7 дней. Колониеобразующая активность выражена в процентах по формуле: К/N×100%, где К – количество колоний на чашку, N – количество засеянных на чашку клеток [8].

Оценка резистентности клеток к химиопрепаратам. Суспензии первичных культур клеток в 90 мкл МЕМ среды помещали в 96-луноч-ные стерильные иммунологические планшеты в концентрации 1×103 клеток на лунку и добавляли лекарственные препараты. В контрольном варианте в инкубационную среду с клетками добавляли деионизированную дистиллированную воду в объеме 10 мкл., соответствующем объему раствора лекарственного препарата. Клетки в планшетах инкубировали 24, 48, 72, 96

час. Оптическую плотность клеток в МЕМ среде измеряли на UV-спектрофотометре Biospec-mini (Shimadzu, Япония) при длине волны 630нм. Скорость роста опухолевых клеток рассчитывали по формуле: R=exp(-t)≈∆N/N, где N – ОП суспензии необработанных химическим соединением опухолевых клеток, ∆N – ОП суспензии обработанных химическим соединением опухолевых клеток [7]. Все эксперименты проведены в трех повторностях. Анализ хромосомных аберраций в клетках первичных культур эпителиальных клеток выполняли стандартным методом [3]. Клетки инкубировали в термостате при 370С в течение 48 час. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 час до окончания инкубации в культуры клеток добавляли 0,002 мкг/ мл колхицина (Sigma). Затем клетки помещали в 0,75 М раствор КCl, и после инкубации в течение 15 мин фиксировали в растворе метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). В каждом приготовленном и окрашенном по методу Гимза препарате анализировали 100 метафаз при помощи микроскопа Leica при увеличении ×1000. Подсчитывали количество клеток с распознаваемыми без кариотипирования хромосомными аберрациями. Митотический индекс рассчитывали по формуле: Р = М/К×100%, где М – количество делящихся клеток в популяции, К –общее количество клеток (не менее 1000) в популяции [3]. Эту же формулу использовали для вычисления количества анеуплоидных клеток. В работе использовали лекарственные препараты в конечных концентрациях мкг/мл: 18 – 5-фтор-дезоксиурацил (5-ФУ), 0,43 – цисплатин (ЦП), 2 – томудекс (ТД) и 0,29 – лейковорин (ЛВ). После обработки препаратами клетки инкубировали в течение 48 час при 370С.

Выделение ДНК и РНК из клеток. К клеткам, суспендированным в буфере LST (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 1мМ MgCl2, 0.25 М сахароза) добавляли равный объем буфера 4× TNLB (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 5% сахароза, 4% Np-40). Затем суспензию клеток центрифугировали при 5 000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток дважды промывали буфером LST, затем ресуспендиро-вали в буфере TNE (10 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА), 1% СДС (лаурилсульфат натрия) с протеиназой К в конечной концентрации 100 мкг/мл. Выделение РНК из клеток проводили с помощью набора TRIzol (Life Technologies, Inc.) согласно прилагаемой инструкции. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-RT). Метод ПЦР с обратной транскрипцией использовали для получения продуктов, которые анализировали в 1% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия (EtBr).Температуру отжига праймеров (табл. 1) с мишенью рассчитывали по формуле: 40С (G+C)+20С×(A+T)–4. Реакцию проводили в 30 мкл инкубационной смеси следующего состава: 2 мкг РНК, 1 µl M-MulV (обратная транскриптаза, СибЭнзим), 300 нM (5,0 пмоль) прямого и обратного праймера, 0,1 µM (2,5 пмоль), 5,0 нM MgCl2, SYBR Green, 10 мM трис–HCl pH 8,0, 3,5 нМ TaqMan ДНК-полимеразы (Sigma), 200 µM каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов и 50 мM KCl. Цикл начинался нагреванием смеси до 250C в течение 5 мин. Проводили 40 циклов при 950C в течение 15 сек, при 520C - 20 сек и при 720C – 25 сек. Реакцию заканчивали охлаждением инкубационной смеси до 40C.

Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле. Разделение ДНК осуществляли в 0,8% агарозном геле в ТАЕ буфере (40 мM трис– HCl pH 8,5, 5,71% ледяной уксусной кислоты, 0,04 мМ ЭДТА) в присутствии EtBr. Электрофорез проводили при 10–15 В/см в течение 120 мин. Результаты протоколировали с помощью BioRad. Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики, парного t-критерия Стьюдента и парного T-критерия Вилкоксона для двух попарно связанных выборок, непараметрического U-теста Манна-Уитни (Mann-Whitney U Test), метода линейного корреляционного анализа Пирсона. Результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m) с указанием стандартного отклонения SD. Различия или показатели связи считались статистически значимыми при p<0,05. Расчеты выполнены при помощи компьютерной программы Excel 2003.

Результаты иccледования

Биопсийный материал отобран по 10 морфо-типам аденокарцином (низкодифференцированная, НД - 3, умеренно-дифференцированная, УД – 6, высоко-дифференцированная, ВД – 1), которым в дальнейшем проводилось 5 курсов химиотерапии в режиме Мейо (5-фторурацил –425 мг/м2 и лейковорин 20 мг/м2 в течение 5 дней, каждые 4–5 недель). Из биопсийного материала получены первичные культуры клеток, в которых определяли уровень мутагенеза, пролиферативной активности и резистентности к противоопухолевым препаратам. Установлено, что в первичных культурах клеток аденокарцином по сравнению с культурами нормальных эпителиальных клеток больше количество ане-уплоидных клеток (соответственно от 2,8±0,2% до 15,2±0,2%, SD 0,36 и 1,87, и 1,6±0,04%,SD 0,7, p<0,05), клеток с хромосомными аберрациями (соответственно от 5.7±0.9 до 15,1±3,7%, SD 2,4 и 9,8, и 0,2±0,002%, SD 0,007, p<0,05). Статистически не значимы уровни митотического индекса в культурах клеток, полученных из био-птатов аденокарцином и нормальных эпителиальных тканей (соответственно от 25,5±2,0% до 41,7±7,3, SD 4,5 и 17,9 и 22,3±0,3%, SD 0,6,p>0,05). Отсутствует корреляционная зависимость уровня клеток с хромосомными аберрациями (2,1±0,01%) и уровня митотического индекса (5,2±0,02%, r=0,2, p>0,05) в первичных культурах клеток ВД аденокарцином, основными характеристиками которых являются большое количество митозов и ядрышек в клетках. Корреляционная зависимость уровня клеток с хромосомными аберрациями (2,9±0,1%) и митотического индекса (36,6±0,2%, r=0,5, p<0,05) обнаружена в культурах клеток, полученных из УД аденокарцином, в которых есть перстневидные и атипичные клетки, некрозы, ядерный полиморфизм. Максимальный коэффициент корреляции между уровнем клеток с хромосомными аберрациями (5,6±0,02%) и митотическим индексом (20,8±0,2%, r=0,9, p<0,05) характерен для культур клеток НД аденокарцином с инвазивным ростом, массивными некрозами, большим количеством митозов, атипичными клетками и ядерным полиморфизмом. Основными типами хромосомных аберраций в опухолевых клетках являются дицентрические хромосомы (0,57±0,03%), парные и непарные хроматидные делеции (0,71±0,01%), количество которых в нормальных эпителиальных клетках соответственно 0,01±0,001% и 0,02±0,004%. Концентрации исследуемых противоопухолевых препаратов, соответствующие их терапевтическим дозам, максимально эффективно снижают количество анеуплоидных клеток, клеток с хромосомными аберрациями и митотический индекс в первичных культурах клеток, полученных из ВД аденокарциномы (рис. 1 А–Г). Цисплатин, лейковорин и 5-фторурацил вызывают снижение количества анеуплоидных клеток в первичных культурах клеток, полученных из НД или УД аденокарцином (рис. 1 А, В, Г). Максимально эффективное влияние на геном-

Рис. 1. Количество клеток с хромосомными аберрациями, полиплоидных и пролиферирующих клеток в культурах клеток, полученных из аденокарцином и обработанных противоопухолевыми препаратами (%) низко- (НД), умеренно- (УД) и высокодифференцированных (ВД)

* – р < 005 по отношению к монопрепарату

й 1 больной

□ 4 больной

□ 6 больной

□ ЮбольмоА

□ К больной

Рис. 2. Влияние 5-фторурацила (5-ФУ), цисплатина (ЦП), томудекса (ТД), лейковорина (ЛВ) и комбинаций 5-фторура-цила (5-ФУ+ЛВ), цисплатина (ЦП+ЛВ), томудекса (ТД+ЛВ) с лейковорином на колониеобразующую активность опухолевых клеток больных колоректальным раком.

А: больные «1», «2» и «9» с низкодифферен цированной аденокарциномой.

Б: больные «3» , «4», «6», «10» с умереннодифференцирован-ной,«8» – с высокодифференцированной аденокарциномами. а – р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «1» и «6»;

б – р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «2» и «8»;

в – р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «9» и «4».

Рис. 3. Влияние лекарственных препаратов и их комбинаций на динамику роста культур клеток, полученных из аденокарцином А,Г низкодифференцированных, Б,Д – умереннодифференцированных, В,Ж – высокодифференцированных.

Рис. 4. Мутация в генах hMSH6 и hMSH2 больных колоректальным раком. Экспрессия генов А – hMSH3 в опухолевых клетках, мутантных по гену hMSH6 – пациенты «4» и «6» с УД и «10» пациент с ВД аденокарциномами; Б – hMSH6 в опухолевых клетках, мутантных по гену hMSH2 – «2», «5», «7» и «9» пациенты с УД аденокарциномами.

ную стабильность и деление клеток всех подгрупп первичных культур клеток аденокарцином показала комбинация 5-фторурацила с лейковорином (рис. 1 Ж). Необходимо отметить, что цисплатин, 5-фторурацил и их комбинации с лейковорином вызвали повышение в 1,4–1,8 раза количества клеток с хромосомными аберрациями в культурах клеток, полученных из УД аденокарцином. Первичные культуры опухолевых клеток отличаются по уровню колониеобразующей активности. Обработка 5-ФУ, ЛВ и 5-ФУ+ЛВ ингибирует колониеобразующую активность опухолевых клеток НД аденокарцином больных «2» и «9» (рис. 2А), а также УД аденокарциномы больного «4» (рис. 2 Б). Цисплатин стимулирует образование колоний в культурах клеток НД аденокарциномы больных «1» и «2», а также УД аденокарциномы больных «3», «4» и «6». Инкубация в течение 7 дней клеток с томудексом и комбинацией этого цитостатика с лейковорином не влияет на колониеобразующую активность клеток НД аденокарциномы больного «1», УД аденокарцином больных «4», «5», «7» и «10». Динамика роста опухолевых клеток, обработанных препаратами in vitro, имеет индивидуальные особенности (рис. 3). Клетки первичных культур, полученные из НД аденокарцином, не чувствительны к цитотокси- ческому действию лекарственных препаратов. Исключением является высокая чувствительность к томудексу клеток, полученных из УД и ВД аденокарцином. Максимально чувствительными к цитотоксическому действию противоопухолевых препаратов являются клетки, полученные из ВД аденокарцином.

Экспериментально выявлено, что комбинации противоопухолевых препаратов эффективнее подавляют развитие опухолевых клеток. Гипермутагенез и снижение чувствительности клеток к цитостатическому действию противоопухолевых препаратов являются признаками мутаторного фенотипа клеток, который возникает в результате мутаций в генах системы репарации ошибочно спаренных оснований и является одной из причин развития КРР [10]. В клетках, мутантных по гену hMSH6, – высокая экспрессия белка Msh3, а в клетках, мутантных по гену hMSH2, не экспрессируются белки Msh3 и Msh6 [9]. Анализ продуктов ПЦР реакции свидетельствует о присутствии мутаций в генах hMSH6 (два пациента с УД и один пациент с ВД аденокарциномами) и hMSH2 (четыре пациента с УД аденокарциномой) (рис. 4). В качестве контроля в анализе использованы праймеры к гену, продуктом которого является β-актин. Высокая пролиферативная активность, геномная нестабильность, низкая чувствительность к противоопухолевым препаратам опухолевых клеток являются показателями отсутствия аллелей дикого типа MSH2 и MSH6 в соматических клетках. Работы по созданию новых стратегий доклинических исследований резистентности опухолевых клеток направлены на создание модели, которая позволит унифицировать химиотерапевтическое лечение и выбрать индивидуальные схемы лечения пациентов [12, 13]. Модели доклинического скрининга цитостатиков с использованием панели музейных переви-

Таблица 1

Праймеры

Ген	F-праймер	R-праймер
β-актин	5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’	5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’
MSH6	5’-GATGGCATTTTCACAAGGATGGG-3’	5’-CTGGCGGATAATGGGTGACAAAC-3’
MSH2	5’-ACAAGGGGCTGGGTTAGCAAAAG-3’	5’-AGTCACCATTCTCTTCCGCTTTCG-3’
PMS2	5’-TTCTCAGGTTATCGGAGCCAGCAC-3’	5’-CTTCGTCCCAATTCACCTCAGTGG-3’
MLH1	5’-CAGGTTTCATTTCACAATGCACGC-3’	5’-TTACCTTCAACATCCAGCAGTGGC-3’
MSH3	5’-GGCAACAGTTCGACTCCTTTCAAG-3’	5’-TTGATACCCTCCCCGTTATCTCGC-3’

ваемых культур неопластических клеток позволяют разработать схему противоопухолевой терапии, но не дают возможность осуществлять индивидуальную прогностическую оценку развития химиорезистентности опухолевых клеток [14].

На наш взгляд, необходим принципиально новый подход к выбору схем лечения больных.

Экспозиция индивидуальных первичных культур клеток с различными молекулярными механизмами действия противоопухолевых препаратов дает возможность оценить генетически детерминированную химиорезистентность клеток и апробировать комбинацию химиопрепаратов, оптимально эффективную для подавления роста и развития опухоли.