Влияние различных фракций эфирного масла вислоплодников реброплодника уральского (Pleurospermum uralense Hoffm) на рост бактерий
Автор: Зыкова И.Д., Тирранен Л.С., Наймушина Л.В.
Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau
Рубрика: Биологические науки
Статья в выпуске: 11, 2016 года.
Бесплатный доступ
В работе впервые представлены резуль-таты исследования компонентного состава эфирного масла вислоплодников реброплодни- ка уральского (Pleurospermum uralense Hoffm), растения семейства Зонтичные, произрас-тающего на территории Сибирского региона (Красноярский край). Растение достаточно широко применяется в народной медицине в качестве противоглистного средства, при легочных заболеваниях, в том числе и при ту-беркулезе легких. Эфирное масло получали методом исчерпывающей гидропародистил-ляции из воздушно-сухого сырья. В процессе перегонки масло фракционировали в зависимо-сти от времени его выделения. Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа показали, что в исследуемых образцах эфир-ного масла содержится более 30 компонентов, 34 из которых, составляющих 98,4-99,8 % от суммы всех компонентов масла в зависимости от образца, нами идентифицированы. Основ-ные компоненты - α-пинен, β-фелландрен, Z-азарон, Е-азарон. Отмечено, что с увеличе-нием продолжительности процесса выделения масла концентрация моно- и сесквитерпенов снижается, а концентрация кислородсодер-жащих компонентов масла, среди которых встречаются все три изомера азарона: α-азарон ((E)-азарон), β-азарон ((Z)-азарон) и γ-азарон (секишон), - возрастает. Известно, что изменение состава влияет на свойства эфирного масла. Результаты исследования антимикробной активности показали, что эфирное масло вислоплодников P. uralense об-ладает слабыми антибактериальными свой- ствами. Причем эфирное масло, неразделен-ное на фракции (цельное), а также его 1-я фракция сдерживают рост только Staphylo-coccus aureus. Вторая фракция масла, содер-жащая наибольшее, по сравнению с другими фракциями, количество альфа-пинена, оказы-вает бактериостатическое действие по от-ношению к Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Компонентный состав 3-й фракции способствует сдержива-нию роста всех взятых в эксперимент бакте-рий. Индифферентны к бактериям 4-я и 7-я фракции. Пятая фракция масла сдерживает рост только Pseudomonas aeruginosa, 6-я фракция не действует на Pseudomonas aeru-ginosa и Escherichia coli, но оказывает бакте-риостатическое действие на остальные бак-терии. Таким образом, результаты проведен-ных исследований показывают, что выделяя отдельные фракции эфирного масла в процес-се его получения, можно получить образцы разного направленного действия по отноше-нию к тому или иному штамму бактерий.
Эфирное масло, компонентный состав, хромато-масс-спектрометрия, антимикроб-ные свойства
Короткий адрес: https://sciup.org/14084536
IDR: 14084536
Текст научной статьи Влияние различных фракций эфирного масла вислоплодников реброплодника уральского (Pleurospermum uralense Hoffm) на рост бактерий
Введение. Сложная экологическая обстановка сегодняшнего дня: загрязнение воздуха, вод, почв, целых экосистем различными полю-тантами, – проявляется в человеческой популяции новыми болезнями и резкой активацией «вновь возникающих старых инфекций». В связи с этим в настоящее время актуальны исследования по изучению состава и свойств биологически активных соединений растительного сырья как источника новых лекарственных средств. Причем для подобных исследований большой интерес представляют растения – доминанты флоры исследуемого региона, запасы которых позволяют осуществлять их массовую заготовку.
Реброплодник уральский ( Pleurospermum uralense Hoffm ) – травянистый многолетник семейства Зонтичные, растение-сорняк, территория его произрастания в Сибирском регионе увеличивается с каждым годом на десятки квадратных километров [1]. Все части растения содержат эфирное масло, основное количество которого сосредоточено в вислоплодниках. Анализ литературных данных позволяет сделать вывод о том, что химический состав P. uralense изучен недостаточно, хотя растение достаточно широко применяется в народной медицине в качестве противоглистного средства, при легочных заболеваниях, в том числе и при туберкулезе легких. Водный настой травы наружно и внутрь назначают при диатезах и других кожных заболеваниях.
Цель исследования : исследование компонентного состава различных фракций эфирного масла P. uralense и его влияния на рост штаммов патогенных бактерий.
Задачи исследования: получение цельного (не поделенного на фракции) эфирного масла вислоплодников P. uralense , а также отдельных фракций; изучение компонентного состава полученных образцов эфирного масла методом хромато-масс-спектрометрии; исследование антимикробной активности различных фракций эфирного масла вислоплодников P. uralense .
Материалы и методы исследования. Вислоплодники P. uralense были собраны в местах естественного произрастания растения в окрестностях города Красноярска вдали от селитебных территорий в августе 2015 г.
Эфирное масло получали методом исчерпывающей гидропародистилляции [2] из воздушносухого сырья, усредненная проба которого составила 1265 грамм. Продолжительность процесса гидропародистилляции была установлена экспериментально на основании изучения динамики изменения выхода эфирного масла во времени и составила 15 часов.
В процессе перегонки масло фракционировали в зависимости от времени его выделения. Компонентный состав определяли методом хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе Agilent Technologies 7890 A c квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5975 C в качестве детектора. Содержание компонентов оценивали по площадям пиков, а идентификацию отдельных компонентов производили на основе сравнения линейных индексов удерживания и полных масс-спектров с соответствующими данными компонентов эталонных масел и чистых соединений, если они имелись. Для идентификации также использовались данные библиотеки масс-спектров Wiley 275 (275 тысяч масс-спектров) [3] и атласа масс-спектров и линейных индексов удерживания [4]. При полном совпадении масс-спектров и линейных индексов удерживания идентификация считалась окончательной.
Физико-химические показатели масла определяли на плотномере и рефрактометре фирмы Mettler Toledo (CША).
Антимикробную активность оценивали по разнице в размерах диаметра колоний тест-бактерий в опыте и контроле. Контролем служили тест-бактерии, соединенные с 0,5 мл дистиллированной воды [5]. В качестве тест-штаммов использовали стандартные типовые культуры микроорганизмов: Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumoniae и Staphylococcus aureus 209р, предоставленные Красноярской краевой клинической микробиологической лабораторией.
Определенное количество эфирного масла помещали на дно чашки Петри, которую закрывали крышкой со свеженанесенными на поверхность среды пятью тест-организмами. Из 2-суточных тест-культур по стандарту мутности готовили суспензию, которой пастеровскими пипетками заполняли лунки станины репликатора. Затем с помощью репликатора делали реплики пяти тест-культур одновременно на поверхность незасеянной среды, разлитой мерно на дно чашек Петри. Одну половину чашек Петри с исследуемым эфирным маслом закрывали другой половиной со свеженанесенными методом реплик тест-бактериями и инкубировали в термостате при 37 oС. Рост тест-бактерий зависел от действия летучих компонентов различных фракций эфирного масла вислоплодников реброплодника уральского на противоположной стороне чашке.
Статистическую обработку проводили по Г.Ф. Лакину [6]. Учитывали среднюю арифметическую величину диаметра колоний ( М ̅ ), ошибку средней арифметической (m). Критерием оценки служила стандартная величина нормированного отклонения (t st ), с которой сравнивалось фактическое значение этого критерия (t разности ) для 3 уровней значимости (95, 99 и 99,9 %).
Воздействие эфирного масла на тест-культуру оценивали как положительное (стимулирующее) или отрицательное (бактерицидное или бактериостатическое), когда размер колоний тест-культур в опыте был соответственно достоверно увеличен или снижен по сравнению с контролем. Если размер колоний в опыте достоверно не отличался от контроля, действие эфирного масла оценивали как нулевое (индифферентное).
Все эксперименты проведены в 5-кратной повторности.
Результаты исследования и их обсуждение. Эфирное масло вислоплодников P. uralense представляет собой легко подвижную жидкость темно-синего цвета тяжелее воды. Физико-химические показатели исследуемых образцов масла представлены в таблице 1.
Согласно данным хромато-масс-спектрометрического анализа, в полученных образцах эфирного масла содержится не менее 30 компонентов, которые легко идентифицируются по линейным индексам удерживания и масс-спектрам отдельных компонентов (табл. 2).
Таблица 1
Изменение показателя преломления и плотности отдельных фракций эфирного масла P. uralense в ходе его выделения
|
Номер фракции |
Время выделения, мин |
nd 20 |
ρ, г/см3 |
|
1 |
60 |
1,5042 |
1,1025 |
|
2 |
75 |
1,5019 |
1,1022 |
|
3 |
135 |
1,5080 |
1,1052 |
|
4 |
150 |
1,5147 |
1,1068 |
|
5 |
150 |
1,5189 |
1,1074 |
|
6 |
195 |
1,5226 |
1,1082 |
|
7 |
135 |
1,5298 |
1,1089 |
Таблица 2
Содержание основных компонентов различных фракций эфирного масла P. uralense
|
Линейный индекс удерживания |
Компонент |
Содержание, % от цельного масла |
||||||||
|
Цельное |
Фр. 1 |
Фр. 2 |
Фр. 3 |
Фр. 4 |
Фр. 5 |
Фр. 6 |
Фр. 7 |
|||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
|
Монотерпены |
||||||||||
|
932 |
α- пинен |
12,0 |
12,2 |
16,0 |
16,4 |
13,2 |
9,6 |
7,9 |
6,1 |
|
|
973 |
сабинен |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,1 |
0,1 |
|
|
975 |
β -пинен |
2,5 |
3,0 |
3,2 |
3,0 |
2,2 |
1,7 |
1,4 |
1,1 |
|
|
991 |
β -мирцен |
0,5 |
0,7 |
0,6 |
0,6 |
0,4 |
0,3 |
0,2 |
0,2 |
|
|
1004 |
α- фелландрен |
1,0 |
1,4 |
1,5 |
1,4 |
0,9 |
0,7 |
0,5 |
0,4 |
|
|
1024 |
кумол |
0,5 |
0,9 |
1,9 |
0,3 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,1 |
|
|
1028 |
β- фелландрен |
10,0 |
16,3 |
18,8 |
12,5 |
7,8 |
6,6 |
5,1 |
2,7 |
|
|
Всего |
26,7 |
34,7 |
42,2 |
34,4 |
24,9 |
19,3 |
15,4 |
10,7 |
||
|
Сесквитерпены |
||||||||||
|
1392 |
β -элемен |
0,3 |
0,6 |
0,3 |
0,3 |
0,3 |
0,3 |
0,3 |
0,1 |
|
|
1422 |
кариофиллен |
3,5 |
2,8 |
2,2 |
3,1 |
3,6 |
3,5 |
3,9 |
2,7 |
|
|
1433 |
β -гурьюнен |
0,1 |
0,2 |
0,2 |
0,3 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
|
|
1456 |
гумулен |
0,3 |
0,3 |
0,2 |
0,3 |
0,3 |
0,3 |
0,3 |
0,2 |
|
|
1484 |
гермакрен D |
2,6 |
2,9 |
1,8 |
2,6 |
2,9 |
2,8 |
2,8 |
2,0 |
|
|
1496 |
(Z,Е)-α-фарнезен |
0,8 |
0,4 |
0,9 |
0,8 |
0,9 |
1,2 |
1,1 |
0,9 |
|
|
1510 |
(Е,Е)-α-фарнезен |
1,0 |
1,3 |
0,4 |
0,4 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
|
1527 |
δ-кадинен |
1,2 |
1,1 |
0,7 |
0,7 |
0,9 |
0,9 |
1,0 |
0,8 |
|
|
1546 |
α-калакорен |
1,0 |
1,3 |
1,2 |
0,8 |
0,8 |
0,8 |
0,7 |
0,6 |
|
|
1565 |
β -калакорен |
0,3 |
0,2 |
0,3 |
0,2 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
|
|
1839 |
неофитодиен |
0,6 |
0,5 |
0,6 |
0,1 |
0,2 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
|
|
Всего |
11,7 |
11,6 |
8,8 |
9,6 |
10,6 |
10,6 |
10,9 |
8,1 |
||
Окончание табл. 2
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
|
Кислородсодержащие соединения |
||||||||||
|
1229 |
цитронеллол |
0,2 |
0,3 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
|
|
1287 |
борнилацетат |
0,6 |
1,0 |
0,5 |
0,5 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
0,3 |
|
|
1306 |
α-терпинеол формиат |
0,8 |
0,9 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,4 |
0,4 |
0,3 |
|
|
1459 |
метилизоэвгенол |
2,0 |
2,1 |
1,9 |
2,6 |
2,2 |
2,2 |
2,3 |
2,1 |
|
|
1489 |
2-фенилэтил-2-метилбутаноат |
1,0 |
0,9 |
0,8 |
0,6 |
0,4 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
|
|
1505 |
шиобунон (эпимер) |
1,2 |
1,4 |
1,0 |
0,9 |
0,9 |
0,9 |
0,8 |
0,7 |
|
|
1533 |
эпи-изо -шиобунон |
2,3 |
2,2 |
1,6 |
1,4 |
1,5 |
1,5 |
1,4 |
1,2 |
|
|
1559 |
элемицин |
0,4 |
0,3 |
0,2 |
0,3 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
|
|
1576 |
γ-азарон |
2,0 |
1,2 |
1,2 |
1,3 |
1,8 |
1,6 |
2,0 |
2,2 |
|
|
1586 |
кариофиллен оксид |
0,8 |
1,0 |
0,9 |
0,6 |
0,3 |
0,1 |
0,3 |
0,1 |
|
|
1610 |
β -оплопенон |
0,7 |
0,9 |
0,7 |
0,7 |
0,7 |
0,8 |
0,6 |
0,5 |
|
|
1702 |
нор-каламен-10-он |
0,5 |
0,7 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,4 |
|
|
1625 |
Z–азарон |
37,8 |
32,9 |
32,0 |
37,0 |
43,8 |
48,8 |
52,1 |
57,1 |
|
|
1684 |
Е–азарон |
9,8 |
6,8 |
7,0 |
7,9 |
9,5 |
11,7 |
12,0 |
14,2 |
|
|
1965 |
ди- н- бутилфталат |
0,5 |
0,6 |
0,2 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
|
|
Всего |
60,6 |
51,0 |
48,1 |
55,0 |
63,1 |
69,6 |
73,1 |
79,8 |
||
|
Углеводороды |
||||||||||
|
1730 |
хамазулен |
0,2 |
0,1 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
|
|
Не идентифицировано |
0,2 |
0,8 |
0,2 |
0,3 |
0,2 |
0,3 |
0,2 |
0,2 |
||
|
Итого |
99,4 |
98,4 |
99,5 |
99,5 |
99,0 |
99,1 |
99,8 |
99,0 |
||
Установлено, что с увеличением времени отгонки происходит увеличение содержания кислородсодержащих компонентов масла, среди которых встречаются все три изомера азарона: α-азарон ((E)-азарон), β-азарон ((Z)-азарон) и γ-азарон (секишон), причем их суммарное содержание возрастает по мере продолжительности выделения масла.
Как известно, изменение компонентного состава влияет на свойства эфирного масла [7]. Результаты исследования антимикробной активности показали, что эфирное масло вислоплодников P. uralens, не разделенное на фракции (цельное), а также его 1-я фракция сдерживают рост только Staphylococcus aureus; 2-я фракция масла отличается повышенным содержанием монотерпенов (в частности α-пинена) и, как следствие, оказывает бактериостатическое действие по отношению к Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli. Компонентный состав 3-й фракции способствует сдерживанию роста всех взя- тых в эксперимент бактерий. Не оказывает никакого действия на штаммы 4-я фракция эфирного масла, компонентный состав которой характеризуется снижением концентрации монотерпенов и увеличением концентрации кислородсодержащих соединений; 5-я фракция масла сдерживает рост только Pseudomonas aeruginosa, 6-я фракция не действует на Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli, но оказывает бактериостатическое действие на остальные бактерии. Последняя, 7-я фракция, содержащая масксимальное количество Z-азарона, не активна по отношению ко всем взятым в эксперимент штаммам бактерий (табл. 3).
Невозможно на сегодняшний день однозначно установить компоненты, отвечающие за то или иное действие масла по отношению к различным штаммам бактерий, так как не исключены синергические и антагонистические эффекты отдельных компонентов масла.
Реакция различных фракций эфирного масла вислоплодников P. uralense на тест-культуры бактерий
Таблица 3
|
Номер фракции |
Klebsiella pneumoniae |
Staphylococcus aureus |
Escherichia coli |
Pseudomonas aeruginosa |
||||||||
|
^^^^^^^н М ± |
t* |
М ± |
t |
_ М ± |
t |
М ± |
t |
|||||
|
Контроль |
Опыт |
Контроль |
Опыт |
Контроль |
Опыт |
Контроль |
Опыт |
|||||
|
1 |
6,74±0,26 |
5,90±0,22 |
2,44 |
5,16±0,21 |
3,78±0,26 |
4,16 |
6,50± 0,14 |
5,82± 0,25 |
2,40 |
9,92±0,19 |
9,60±0,55 |
0,60 |
|
Индифферентное действие |
Бактериостатическое действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
|||||||||
|
2 |
6,74±0,26 |
5,92±0,26 |
2,23 |
5,16±0,21 |
3,08±0,26 |
6,27 |
6,50± 0,14 |
5,26±0,25 |
4,30 |
9,92±0,19 |
9,00±0,00 |
4,80 |
|
Индифферентное действие |
Бактериостатическое действие |
Бактериостатическое действие |
Бактериостатическое действие |
|||||||||
|
3 |
6,74±0,26 |
5,62±0,22 |
3,30 |
5,16±0,21 |
4,20±0,08 |
4,34 |
6,50± 0,14 |
5,12±0,22 |
5,33 |
9,92±0,19 |
8,46±0,09 |
6,89 |
|
Бактериостатическое действие |
Бактериостатическое действие |
Бактериостатическое действие |
Бактериостатическое действие |
|||||||||
|
4 |
6,74±0,26 |
6,16±0,26 |
1,57 |
5,16±0,21 |
5,00±0,29 |
0,44 |
6,50± 0,14 |
6,30 ± ,21 |
0,28 |
9,92±0,19 |
9,30±0,45 |
1,57 |
|
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
|||||||||
|
5 |
6,74±0,26 |
6,10±0,22 |
1,86 |
5,16±0,21 |
4,80±0,31 |
0,97 |
6,50± 0,14 |
6,50±0,31 |
0 |
9,92±0,19 |
8,82±0,35 |
2,76 |
|
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
Бактериостатическое действие |
|||||||||
|
6 |
6,74±0,26 |
6,02±0,08 |
2,62 |
5,16±0,21 |
4,00±0,07 |
6,21 |
6,50± 0,14 |
6,24±0,23 |
1,00 |
9,92±0,19 |
9,00±0,35 |
2,29 |
|
Бактериостатическое действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
|||||||||
|
7 |
6,74±0,26 |
6,28±0,19 |
1,42 |
5,16±0,21 |
4,80±0,26 |
1,09 |
6,50± 0,14 |
6,54±0,21 |
0,15 |
9,92±0,19 |
9,26±0,43 |
1,40 |
|
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
|||||||||
|
Цель- |
6,52±0,08 |
6,80±0,21 |
1,24 |
5,16±0,15 |
4,38±0,13 |
3,9 |
6,25±0,05 |
6,10±0,10 |
1,32 |
6,59±0,07 |
6,56±0,09 |
0,26 |
|
ное |
Индифферентное действие |
Бактериостатическое действие |
Индифферентное действие |
Индифферентное действие |
||||||||
Примечание: t* – t разности (достоверно при t st ≥ 2,57 для р = 0,95; при t st ≥ 4,03 для р = 0,01; при t st ≥ 6,86 для р = 0,0).
Вестник КрасНАУ. 2016. №11
Выводы . Таким образом, регулируя время отгонки эфирного масла, тем самым контролируя его состав, можно получить фракции, обладающие достоверным бактериостатическим действием к тем или иным культурам исследуемых бактерий.
Список литературы Влияние различных фракций эфирного масла вислоплодников реброплодника уральского (Pleurospermum uralense Hoffm) на рост бактерий
- Махлаюк В.П. Лекарственные растения в народной медицине. -М.: Нива России, 1992. -478 с.
- Ефремов А.А., Зыкова И.Д. Компонентный состав эфирных масел хвойных растений Сибири. -Красноярск: Изд-во СФУ, 2013. -132 с.
- McLafferty F.W. The Wiley. NBS Registry of Mass Spectral Data; Wiley. -London: Inter-science, 1989. -563 p.
- Ткачев А.В. Исследование летучих веществ растений. -Новосибирск: Наука, 2008. -969 с.
- Лакин Г.Ф. Биометрия. -М.: Высш. шк., 1990. -352 с.
- Тирранен Л.С. Роль летучих метаболитов в межмикробном взаимодействии. -Новоси-бирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1989. -104 с.
- Ефремов А.А., Зыкова И.Д., Дрожжина М.В. Изменение компонентного состава и физико-химических показателей эфирного масла корневищ ACORUS CALAMUS (ARACEAE) в зависимости от времени его выделения//Растит. ресурсы. -2011. -№ 1. -С. 118-123.
