Влияние различных спиртов на дегидрогеназную активность активного ила

Загрязненные воды современных нефтехимических и фармацевтических производств представляют собой многокомпонентные системы, содержащие неорганические и органические соединения различных классов с большим удельным весом алифатических спиртов. Спирты в значительной степени отличаются друг от друга по физико-химическим свойствам, строению и способности к биологическому окислению. Эти вещества могут оказать токсическое действие как на микрофлору очистных сооружений, так и на микро- и макроорганизмы водоемов. К сожалению, в современной литературе данные о степени токсичности спиртов на микробиоценоз активного ила немногочисленны и противоречивы. [1,3]. В связи с этим настоящее исследование приобретает важное теоретическое значение и практический интерес.

Цель исследования: изучение влияния некоторых спиртов на активность дегидрогеназ микробиоценоза активного ила.

Методика исследования. В качестве объекта исследования был выбран активный ил регенератора первой секции аэраторов городских очистных сооружений МП «Самараводоканал». Определение общей дегидрогеназной активности проводили методом [2].В центрифужные пробирки вносили по 4 мл тщательно перемешанной суспензии активного ила (активный ил и сточная жидкость аэротенка), добавляли 1 мл 0,15 М фосфатного буфера (рН = 7,4) и 0,1 мл 1% раствора ТТХ. Одну пробирку оставляли в качестве контрольной, а в остальные наливали по 1 мл растворов спиртов различной концентрации. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивали. Пробы инкубировали 30 минут в термостате при 37^оС, а затем центрифугировали при

Шаталаев Никита Иванович, аспирант

4000 оборотах в минуту в течение 3 минут. Надосадочную жидкость из каждой пробирки сливали и к осадку добавляли по 5 мл этанола. Содержимое каждой пробирки перемешивали и, закрыв предварительно пробками, энергично встряхивали для экстракции образовавшегося формазана 3 минуты. После этого пробирки центрифугировали 3 минуты при 4000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость отбирали и фо-токолориметрировали при длине волны 490 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Относительную дегидрогеназную активность рассчитывали как процентное отношение оптической плотности опытной пробы к оптической плотности контрольной пробы.

Результаты исследования и их обсуждение. Анализ полученных данных показывает (табл. 1), что добавление водных растворов спиртов различной концентрации (начиная с 0,01 мг спирта на 1 мл суспензии) к активному илу вызывает изменение общей дегидрогеназной активности. Резкий подъем активности ферментов – практически в 2 раза (+89,7%, р<0,05) установлен для изопропанола. При добавлении пропанола и пентанола активность дегидрогеназ увеличилась в среднем на 30%, а при внесении растворов этанола, бутанола и октанола в среднем на 15-20%. В остальных случаях отмечается тенденция к росту активности ферментов.

При добавлении спиртов из расчета 0,02 мг на 1 мл суспензии ила вновь обращает внимание резкое повышение функциональных возможностей дегидрогеназ (+131,2%;р<0,05), вызываемое изопропанолом. Практически на 40% повышается активность энзимов при контакте с пропанолом и пентанолом. Активизация ферментов ила наблюдается при добавлении этанола (+19,2%; р<0,05), бутанола (+22,9%; р<0,05) и октанола (+26,7%; р<0,05). Сохраняется тенденция к увеличению работоспособности дегидрогеназ при инкубации ила с метанолом (+12,8%; р<0,05), изобутанолом (+14,4%; р<0,05), изопентанолом (+13,2%; р<0,05).

Обращает внимание значительный рост активности дегидрогеназ при добавлении к илу этанола (+78,5%; р<0,05), пропанола (+110,2%; р<0,05), изопропанола (+172,7%; р<0,05), пентанола (+50,5%; р<0,05) в количестве 0,1 мг спирта на 1 мл суспензии. Для бутанола, изобутанола, изопентанола и октанола динамика составила соответственно +34,1%; +35,6%; +32,4%; +38,8% (р<0,05). После инкубации с метанолом было обнаружено повышение активности дегидрогеназ на 15,1% (р<0,05).

Таблица 1. Относительная дегидрогеназная активность микроорганизмов активного ила при действии спиртов

Инкубация активного ила со спиртами в концентрации 0,2 мг на 1 мл суспензии позволила выявить противоположно направленные изменения общей дегидрогеназной активности. В пробе с добавлением октанола наблюдалось угнетение функций ферментов на 16,0%; р<0,05. В остальных суспензиях выявлено увеличение активности дегидрогеназ, особо выраженное в смеси с изопропанолом (+174,3%; р<0,05), этанолом (+94,1%; р<0,05), пропанолом (+128,6%; р<0,05), бутанолом (+58,7%; р<0,05), изобутанолом (+58,4%; р<0,05). Однако при сопоставлении полученных показателей для концентраций спиртов в суспензиях 0,1 и 0,2 мг/мл, выявлены следующие закономерности.

В пробах с метанолом активность дегидрогеназ увеличивается абсолютно одинаково (+15,1%; р<0,05). Практически на одну и ту же величину возрастает активность ферментов в суспензиях с изопропанолом (172,7% и 174,3%), пентанолом (50,5% и 52,9%), изопентанолом (32,4% и 34,7%). Показатель общей дегидроге-назной активности, полученный после инкубации ила со спиртами в концентрации 0,5 мг/ мл суспензии, позволяет сделать вывод о росте функциональной способности ферментов опытных проб относительно контрольной. Это прежде всего относится к смесям содержащим этанол (+113,2%; р<0,05), пропанол (+155,3%; р<0,05) и изобутанол (+89,6%; р<0,05). Об имеющейся тенденции к активации ферментов можно сказать про смеси, содержащие пентанол и изопентанол. В пробах, содержащих метанол, изопропанол, бутанол в концентрации 0,5 мг/мл суспензии активность дегидрогеназ изменяется менее чем на 4% относительно показателя для концентрации 0,2 мг / мл суспензии.

Анализ данных об активности дегидрогеназ ила после инкубации со спиртами в концентрации

1,0 мг/мл суспензии показал следующее. Значимое увеличение дегидрогеназной активности отмечено для смесей содержащих пропанол (+185,9%; р<0,05), этанол (+180,4%; р<0,05), изобутанол (+108,4%; р<0,05). В меньшей степени этот подъем характерен для смесей содержащих бутанол (59,2%; р<0,05), изопентанол (+53,9%; р<0,05), пентанол (+50,0%; р<0,05), а также проб с метанолом (+19,8%; р<0,05). Однако если сравнить показатели относительной де-гидрогеназной активности ферментов при инкубировании со спиртами в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/мл суспензии, то увеличение активности фермента с повышением концентрации установлено для изобутанола (на 18,8%), на 30,6% для пропанола и на 67,2% для этанола. Сопоставляя величины относительной дегидрогеназной активности при концентрациях 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл можно отметить появление тенденции к снижению активности в смесях, содержащих пентанол (- 9,5%). Проведенные исследования показывают, что добавление водных спиртовых растворов к активному илу в концентрации 2,0 мг/мл суспензии характеризуется положительной величиной относительной дегидрогеназной активности. Сравнивая показатели для концентраций 1,0 мг/мл и 2,0 мг/мл мы можем отметить что они, либо абсолютно одинаковы (для метанола - 19,8%: для этанола - 180,4%), либо свидетельствуют о начавшемся угнетении функционирования ферментов (для смесей с бутанолом, изобутанолом, пентанолом, изопентанолом).

Таким образом, нами были установлены концентрации насыщения для ряда алифатических спиртов. Таковыми оказались для: метанола - 80-100 мг/г ила, этанола - 180-190, пропанола -350-370, изопропанола - 40, бутанола - 35-40, изобутанола - 170-180, пентанола - 20-25, изопентанола - 150-160, октанола - 14-20 мг/г ила.

Выводы:

• 1.    С повышением концентрации алифатических спиртов до определенного значения (концентрация насыщения) скорость ферментативной реакции возрастает. Дальнейшее повышение содержания спиртов приводит к субстратному ингибированию дегидрогеназ микробиоценоза активного ила.

• 2.    С увеличением числа атомов углерода в радикале алифатических спиртов и степени его разветвления отмечается снижение степени сродства субстрата к ферменту. Наибольшим сродством к ферментам обладают этанол, пропанол, изопропанол и изобутанол.

• 3.    Установленные концентрация насыщения для алифатических спиртов могут быть использованы для составления нормативной документации, регламентирующей уровень содержания спиртов в загрязненных водах, поступающих на очистные сооружения.