Влияние различных видов ионизирующего излучения и длительности культивирования на уровень генетической изменчивости сомаклонов сои

Введение. Новая возможность расширения генетического разнообразия в селекции открылась с организацией биотехнологических методов исследований. Полученные на искусственных питательных средах в условиях in vitro растения-регенеранты, как правило, в той или иной степени отличаются от исходных форм и могут являться исходным материалом для традиционной селекции данной культуры, поскольку они представляют собой сомаклональные варианты [1].

Использование сомаклональной изменчивости в сочетании с отбором позволило О.А. Ро-жанской создать ценный селекционный материал сои, ярового рапса, нута, эспарцета, люцерны с признаками скороспелости, повышенной семенной и кормовой продуктивности, улучшенного химического состава, устойчивости к неблагоприятным гидротермическим условиям и патогенам [2].

В Казахстане группой ученых (С.В. Дидоренко, Ю.Г. Карягиным и Б.М. Жанысбаевым) сомаклональная изменчивость применяется как источник генетического разнообразия в создании новых форм сои [3].

В Приморском НИИСХ коллективом двух лабораторий: биотехнологии и селекции сои – с использованием метода культуры тканей создан первый в России сорт сои Приморская 81, который с 2004 г. районирован [4].

Важным моментом в технологии регенерации путем органогенеза являются условия, способствующие возникновению генетических изменений в рекомбинантах. По данным M.S. Wright и др. [5], дополнительные почки в пазухах семядольного узла сои закладываются de novo под влиянием 6-бензиламинопурина (БАП). R.A. Graybosch, M.E. Edge и X. Delannay [6] стимулировали побегообразование из вновь образовавшихся и ранее существовавших меристематических участков проводящей ткани семядольного узла на среде с БАП. Среди полученных линий исследователи наблюдали вариабильность по урожайности и другим признакам. A.H. Freytag с коллегами [7] изучали процесс регенерации растений сои из семядольного узла эксплантов эпикотиля. Авторы выявили генотипы, в потомстве регенерантов у которых отклонения от нормы появлялись чаще.

По мнению Рожанской [8], изоляция семядольных узлов на стадии развития проростка нарушает контролирующее влияние организма, приводит к неорганизованной пролиферации ткани и способствует возникновению генетических изменений у адвентивных почек, формирующихся в семядольных пазухах изолированных узлов.

Величины вариабельности признаков у регенерантов сои недостаточно высокие, поэтому с целью повышения генетического разнообразия мы использовали в качестве исходных эксплантов ткани мутантов. Существует много приёмов получения индуцированных мутаций. В основе их лежит воздействие на организм различными физическими и химическими факторами, называемыми мутагенами. Действуя ими на растения, можно резко повысить их мутационную изменчивость. В селекционной работе используются любые виды ионизирующих излучений. Наиболее широко применяют рентгеновское, гамма- и нейтронное излучения. [9].

Наряду с этим существует вопрос о влиянии длительности культивирования на уровень генетической изменчивости сомаклонов сои. Как считают некоторые исследователи, уровень изменчивости сомаклонов повышается при более продолжительном культивировании ткани. Рядом авторов В.С. Шевелуха и др. [10], Mс Coy и др. [11] определено, что чем длительнее эксплант находится на питательной среде, тем больше вероятность получить регенеранты, отличающиеся от исходных форм.

Однако по данным M.S. Wright и др. [5], проводивших гистологический анализ пазух семядольного узла у исследуемых ими растений сои, через 6 дней после прорастания семян на среде с БАП базальные участки эпикотиля и семядолей, примыкающие к придаточным почкам, становятся меристематическими зонами. В эпидермальных и субэпидермальных тканях формируются прорегенеративные очаги, способные к морфогенезу, возникают новообразования – дополнительные адвентивные почки.

На основании вышеизложенных результатов и мнений ученых, нами была поставлена задача выяснить, оказывают ли влияние различные виды ионизирующего излучения и длительность культивирования на уровень генетической изменчивости сомаклонов сои.

Материалы и методы. Исследования проводились в лаборатории биотехнологии Приморского НИИСХ, в качестве исходных форм использовали сорт Ходсон и его мутанты. Для получения мутантов сухие семена обрабатывали в Институте цитологии и генетики СО РАН следующими электромагнитными излучениями: красным когерентным светом оптического квантового гелий-неонового генератора (лазера) с длиной волны 632,8 нм при плотности потока мощностью 0,08 мВт/см² в течение 15 мин; γ-излучением кобальтовой пушки в дозе 50 грей.

В качестве первичных эксплантов использовали семядольные узлы стерильных микрорастений. Для получения последних зрелые семена стерилизовали в разделительной воронке концентрированной серной кислотой (H2SO4) в течение 2-х мин, с последующей многократной отмывкой стерильной дистиллированной водой согласно методике, предложенной А.М. Смирновым, в изложении В.А. Тильбы [12].

Семядольные узлы культивировали на питательной среде 1/2MS + БАП (1,13 и 0,23 мг/л) до 60 дней. Адвентивные побеги, образовавшиеся de novo через 7-14 дней (R 0 -1) и через 31-60 дней (R 0 -2), снимали и помещали на среду 1/2MS+ИМК (0,5 мг/л), не содержащую БАП, для дальнейшего роста и развития.

Степень поражения (%) грибными патогенами: септориозом (Septoria glycines), церкоспоро-зом (Сercospora sojina), пероноспорозом (Peronospora manshurica) – определяли при искусственном заражении листовой поверхности на жестком инфекционном фоне совместно с сотрудниками лаборатории селекции сои ПримНИИСХ по методике ВИР [13] и согласно Международному классификатору [14].

Биохимический состав семян исходных форм и регенерантных линий проведен во ВНИИ сои на ИК-сканере Nir-42 по следующим показателям: аминокислоты (аргинин, валин, пролин, глютамин, лизин, гистидин, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, аланин+глицин, треанин, серин, аспарагиновая кислота), жирные кислоты (пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая), минеральные элементы (К, Са, Р, Мg), белок, масло. Оценка сомаклонов по химическому составу дана на основании классификатора [14].

Регенеранты третьего поколения выращивали в полевых условиях в соответствии с принятой для Приморского края агротехникой.

Статистическая обработка материала проведена методом дисперсионного анализа в изложении Б.А. Доспехова [15].

Для проведения генетического анализа все исследуемые образцы были разделены на три группы, каждая из которых была представлена растениями исходной формы и ее сомаклонами. Первая группа – сорт Ходсон и сомаклоны R 0 -1-690, R 0 -1-691, R 0 -1-699, R 0 -1-717, R 0 -1-722 и R 0 -2617. Вторая группа – популяция Ходсон- L , растения которой получены из облученных лазером семян, и сомаклоны R 0 -1-731, R 0 -2-616 и R 0 -2-623. Третья группа – популяция Ходсон-γ, растения которой получены из облученных γ-излучением семян, и сомаклоны R 0 -1-651, R 0 -1-688, R 0 -1-715 и R 0 -2-615.

Выделение ДНК и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в БПИ ДВО РАН, как было описано нами ранее [16]. Для анализа полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК 52 образцов использовали 12 праймеров, комплементарных к микросателлитным повторам (табл. 1). При оценке электрофореграмм учитывали только четко видимые и воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты (ампликоны). Для каждого из праймеров были составлены бинарные матрицы, в которых присутствие или отсутствие в спектре фрагментов с одинаковыми молекулярными массами обозначали как "1" или "0". Разная интенсивность полос одинаковых по размеру ампликонов у сравниваемых образцов не учитывалась. Для определения длины фрагментов использовали маркер молекулярных масс – EcoRI + HindIII-рестрикты ДНК фага лямбда (Fermentas, Литва).

Таблица 1 – Праймеры, используемые в данной работе

Код праймера	Нуклеотидная последовательность (5’–3’)	Код праймера	Нуклеотидная последовательность (5’–3’)
пр812	(GA) 8 T	прC1	(AGC) 6 T
пр825	(AC) 8 T	прC3	(AGC) 6 C
пр840	(GA) 8 (CT) T	прC4	(AGC)6G
пр842	(GA) 8 (CT)G	прC5	(TCG) 6 G
пр888	(CGT) (ACT) (CGT) (CA) 7	прS1	(CA) 8 TG
пр889	(AGT) (CGT) (AGT) (AC) 7	прS10	(GA) 8 TC

Объединенная бинарная матрица была использована для расчета частот фрагментов, доли полиморфных локусов ( P ), генного разнообразия ( H ) и индекса Шеннона ( SI ) с помощью пакета программ POPGENE [17]. Для определения генетических расстояний Нея-Ли (D N ) и построения дендрограммы генетических взаимоотношений между отдельными растениями на основе значений D N посредством невзвешенного парно-группового метода кластерного анализа (UPGMA) с бутстрэпными оценками степени надежности порядка ветвления (1000 реплик) использовали пакет программ TREECON [18, 19].

Результаты и обсуждения . В результате ISSR-анализа выявлено 183 фрагмента, из них 164 были полиморфными. Популяция Ходсон-γ характеризовалась наибольшим уровнем полиморфизма и значениями генного разнообразия и индекса Шеннона, чем все другие исследуемые популяции исходных форм (табл. 2).

Таблица 2 – Основные показатели генетической изменчивости исходных форм сои

Сорт/популяция	Доля полиморфных локусов ( P, %)	Генное разнообразие ( H )	Индекс Шеннона ( SI )
Ходсон	12,57	0,041	0,062
Ходсон- L	10,93	0,040	0,062
Ходсон-γ	18,03	0,063	0,099

Генетические дистанции (D_N) между парами анализируемых образцов (популяций) варьировали, достигая 10-кратного различия (табл 3). Наименьшее значение D N (0,0642) отмечено между исходными популяциями Ходсон-γ и Ходсон- L , наибольшее (0,6043) – между сомаклоном R 0 -2-616 популяции Ходсон- L и сомаклоном R 0 -1-691 сорта Ходсон.

Наибольшими генетическими отличиями от исходной формы характеризуются сомаклоны R 0 -1-691 и R 0 -1-699 в первой группе, R 0 -2-616 и R 0 -2-623 – во второй и R 0 -2-615 – в третьей (табл. 4). Однако уровень генетической изменчивости исследованных сомаклонов не зависит от длительности культивирования первичных эксплантов на питательной среде.

Таблица 4 – Значения генетических дистанций между сомаклонами и выборками их исходных форм и длительность культивирования сомаклонов in vitro

Сомаклон	Длительность культивирования in vitro, сут.	Генетические дистанции ( D N)
		Ходсон	Ходсон- L	Ходсон-γ
R 0 -1-690 (Ходсон)	7-14	0,1789	0,4695	0,5235
R0-1-691 (Ходсон)	7-14	0,5451	0,5694	0,5937
R 0 -1-699 (Ходсон)	7-14	0,3369	0,3188	0,3324
R 0 -1-717 (Ходсон)	7-14	0,2108	0,4433	0,4547
R 0 -1-722 (Ходсон)	7-14	0,1646	0,4772	0,5084
R0-2-617 (Ходсон)	32	0,1993	0,5645	0,5904
R0-1-731 (Ходсон- L )	7-14	0,2098	0,4393	0,4550
R 0 -2-616 (Ходсон- L )	48	0,2643	0,5340	0,5596
R 0 -2-623 (Ходсон- L )	57	0,2249	0,5245	0,5571
R0-1-651 (Ходсон-γ)	7-14	0,2722	0,3650	0,3735
R0-1-688 (Ходсон-γ)	7-14	0,2173	0,4456	0,4589
R0-1-715 (Ходсон-γ)	7-14	0,2952	0,3392	0,3678
R 0 -2-615 (Ходсон-γ)	31	0,2566	0,5355	0,5646

Длительность культивирования семядольных узлов сорта Ходсон не влияет на генетическую изменчивость его сомаклонов. В то время, как для возникновения генетической дифференциации сомаклонов популяций Ходсон- L и Ходсон-γ от их исходных форм, вероятно, необходимо более длительное культивирование (табл. 4).

К третьему поколению из числа изучаемых нами сомаклонов были исключены стерильные, слабофертильные формы с нежизнеспособными семенами, а также непродуктивные и характеризующиеся другими отрицательными признаками (R₀-1-691, R₀-1-699, R₀-1-690, R₀-2-617, R₀-1-651 и R₀-1-688). Среди оставшихся сомаклонов по биохимическим показателям (содержание белка, гистидина, линолевой и олеиновой кислот) исходную форму превышали: сомаклон R617 первой группы ( D N 0,1993), все сомаклональные линии второй группы и регенерант R615 третьей группы ( D N 0,5646) (табл. 5). Кроме того, сомаклон R623 второй группы ( D N 0,5245) обладал высоким уровнем устойчивости к церкоспорозу, а регенерант R715 третьей группы ( D N 0,3678) характеризовался высоким уровнем устойчивости к пероноспорозу и церкоспорозу.

Следует отметить, что регенерантные формы, имеющие наибольшие генетические отличия от исходных форм, не всегда выделяются по биохимическим показателям, тогда как сомаклоны со средним (R715) и низким (R617) уровнем генетической изменчивости могут превышать исходную форму по селекционным признакам. В результате исследований в третьем поколении были выделены сомаклоны: R616, R623 и R617, которые рекомендованы селекционерам в качестве исходного материала для селекции сои в Приморском крае.

На рисунке представлена некорневая дендрограмма генетических взаимоотношений между исследуемыми образцами. Анализируемые растения распределились в два кластера: первый объединяет с высокой степенью достоверности (индекс бутстрепа 100 %) все растения популяций Ход-сон- L и Ходсон-γ, которые группируются соответственно их происхождению; второй объединяет все растения исходного сорта Ходсон (индекс бутстрепа 100 %) и все исследуемые сомаклоны, за исключением двух (R₀-1-691 и R₀-1-699). Эти два сомаклона сорта Ходсон имеют наибольшие генетические отличия как от исходной формы, так и от всех других.