Влияние регуляторных пептидов на подвижность сперматозоидов человека in vitro

Мясоедов Н.Ф. – академик РАН, руководитель отдел химии физиологически активных веществ института молекулярной генетики РАН

ногочисленные исследования свидетельствуют о том, что в последние десятилетия снижается уровень мужской фертильности, что в значительной степени опреде ляет число бесплодных браков в разных странах мира. Демографическая ситуация в нашей стране в настоящее время характеризуется снижением рождаемости, ведущей причиной которого является мужской фактор. По данным ВОЗ уровень мужской фертильности снижается, что создает проблему медико-социальной направленности [1]. Одной из актуальных задач современной андрологии является поиск агентов, способных повышать подвижность сперматозоидов, а также увеличивать их устойчивость к действию повреждающих факторов различной природы. Значительный практический интерес в этом плане представляют регуляторные олигопептиды, некоторые из них обладают способностью повышать выживаемость отдельных типов клеток при неблагоприятных воздействиях [2-6]. Важным аспектом этих исследований является отбор из большого числа как уже существующих, так и вновь синтезируемых пептидов, тех, которые обладают максимально выраженным эффектом в отношении данного типа клеток.

В связи с вышеизложенным нами было изучено влияние ряда регуляторных олигопептидов на подвижность сперматозоидов человека in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на сперматозоидах человека из эякулята, полученного общепринятым способом. После разжижения через 40-60 мин эякулят микроскопировали в проходящем свете при увеличении х 400 на микроскопе Amplival. Оценку подвижности сперматозоидов и другие параметры эякулята осуществляли по стандарту ВОЗ 4-го издания [1].

Подвижность сперматозоидов (общая и активная) рассчитывалась как содержание в эякуляте подвижных клеток на 100 проанализированных. Эксперименты были проведены на эякулятах от 10 пациентов. Эксперименты проводили при температуре 20–22ºС. Из полученного образца эякулята отбирали по 1 мл для опыта и контроля. В опытную пробирку вносили тот или иной пептид в соответствующей концентрации, что отражено в таблицах 1-3. Пептиды синтезированы в отделе химии физиологически активных веществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Инсти- тута молекулярной генетики Российской академии наук (руководитель – академик РАН Н.Ф. Мясоедов).

Полученные результаты представлены в виде средних арифметических значений исследованных параметров и их среднеквадратических ошибок. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента. Различия между средними арифметическими значениями параметров считали достоверными при р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Данные, полученные при изучении влияния гептапептида семакса на подвижность (активную и общую) сперматозоидов человека представлены в таблице 1. Очевидно, что действие этого гептапептида приводит к существенному (в 3-5 раз) возрастанию активной подвижности сперматозоидов по сравнению с исходным уровнем уже через 1 час инкубации. Этот эффект пептида оказывается существенно менее выраженным в случае рассмотрения общей подвижности сперматозоидов. Выраженность стимулирующего действия гептапептида на оба типа подвижности не меняется при возрастании времени инкубации от 1го до 3-х часов. Однако подвижность сперматозоидов несколько возрастает при увеличении концентрации пептида от 10 до 1000 мкг/мл.

Пептид селанк практически не оказывал существенного влияния на подвижность сперматозоидов, за исключением небольшого повышения их активной подвижности при 3-х часовой инкубации эякулята с пептидом в концентрации 1000 мкг/мл (табл. 2).

Влияние на подвижность сперматозоидов группы синтезированных пептидов – Pro-Gly-Pro, Arg-Pro-Gly-Pro, Arg-Glu-Arg-Pro-Gly-Pro, Phe-Gly-Gly-Phe-Val-Gly-Pro – изучалось при их концентрация во всех случаях 1000 мкг/мл (табл. 3). Как видно из данных, приведенных в таблице, инкубация сперматозоидов с исследованными пептидами в течение одного и трех часов не приводила к суще-

Таблица 1. Влияние гептапептида семакса на подвижность сперматозоидов

Показатель	Исходные данные	Время инкубации				Контроль (3 часа)
		1 час		3 часа
Концентрация пептида, мкг/мл	0	10	1000	10	1000	0
Активная подвижность, %	12,5±1,2	53,0±10,1*	63,2±10,0*	51,1±10,5*	64,4±9,7*	24,4±4,9*
Общая подвижность, %	39,1±1,9	68,7±7,1*	75,9±6,7*	64,9±8,0*	77,4±6,4*	42,8±4,0

* различия величин подвижности по сравнению с исходным уровнем достоверны

Таблица 2. Влияние пептида селанка на подвижность сперматозоидов

Показатель	Исходные данные	Время инкубации				Контроль (3 часа)
		1 час		3 часа
Концентрация пептида, мкг/мл	0	10	1000	10	1000	0
Активная подвижность, %	16,6±2,6	20,4±3,1	21,6±3,8 130%	17,2±2,4	23,8±4,5*	15,6±1,8
Общая подвижность, %	42,3±3,4	44,7±4,3	49,3±4,8	40,7±5,1	49,4±5,2	40,8±3,7

* различия величин подвижности по сравнению с исходным уровнем достоверны

Таблица 3. Влияние регуляторных пептидов на подвижность сперматозоидов

Показатель	Исходные данные	Время инкубации			Контроль (3 часа)
		30 мин	1 час	3 часа
Pro-Gly-Pro
Активная подвижность, %	20,5±3,6	35,3±10,3*	24,7±2,7	26,0±3,4	21,6±2,9
Общая подвижность, %	41,2±4,1	54,1±7,7*	46,5±2,2	49,2±3,2	43,0±2,7
Arg-Pro-Gly-Pro
Активная подвижность, %	20,6±5,1	21,2±4,7	20,6±5,1	23,5±6,0	21,3±4,3
Общая подвижность, %	42,3±5,6	43,5±4,8	22,0±3,5	39,8±6,6	42,6±3,3
	Arg-Glu-Arg		-Pro-Gly-Pro
Активная подвижность, %	21,1±5,2	60,6±9,8*	22,2±3,6	22,2±4,8	21,3±4,3
Общая подвижность, %	43,3±5,4	79,6±10,3*	44,6±4,2	41,3±5,3	41,5±3,1
Phe-Gly-Gly-Phe-Val-Gly-Pro
Активная подвижность, %	18,3±2,2	38,2±13,9*	21,2±3,8	18,0±3,7	16,6±2,5
Общая подвижность, %	40,6±3,8	53,7±11,1	40,2±5,3	36,5±4,9	35,7±4,0

* различия величин подвижности по сравнению с исходным уровнем достоверны

ственному возрастанию их подвижности, которая приближалась к уровню контроля. Достоверный эффект стимуляции подвижности наблюдался лишь при 30-ти минутной инкубации клеток с пептидами Pro-Gly-Pro, Arg-Glu-Arg-Pro-Gly-Pro и Phe-Gly-Gly-Phe-Val-Gly-Pro. При этом, как и в случае с семаксом, возрастание активной подвижности сперматозоидов было более выражено, чем общей. В случае тетрапептида Arg-Pro-Gly-Pro возрастания подвижности сперматозоидов не наблюдалось.

Таким образом, представленные в нашей работе данные показали, что действие ряда регуляторных пептидов приводит к возрастанию относительного содержания в популяции сперматозоидов клеток с высокой скоростью движения. При анализе полученных данных следует отметить, что, как было ранее показано Э.Р. Сафаровой и соавт. для культивируемых клеток феохромоцитомы крысы РС12, пептид семакс способен не только предотвращать повреждение клеток, но и активировать процессы, ведущие к восстановлению ранее поврежденных клеток [7]. В этой связи, полученные нами результаты позволяют предположить, что действие некоторых пептидов вызывает восстановление нарушенной по каким-то причинам подвижности сперматозоидов. К сожалению, вопрос о механизмах защитного и восстанавливающего действия пептидов на клетки еще не решен, однако, в литературе имеются указания на то, что эти свойства пептидов (в частности семакса и pro-gly-pro) в определенной степени связаны с их влиянием на кальциевый гомеостаз и функциональное состояние митохондрий [8]. Кроме того, как известно, подвижность сперматозоидов обеспечивается за счет энергии гликолиза, одним из ферментов которого является глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-наза – ГАФДс, прочно связанная в сперматозоиде с фиброзным слоем жгутика [9-11]. По мнению авторов, подвижность сперматозоидов в существенной степени зависит от активности этого фермента, который весьма чувствителен к повреждающему действию активных форм кислорода (АФК). Это позволяет предположить, что возрастания подвижности сперматозоидов можно добиться с помощью ряда агентов (в том числе, возможно, и некоторых регуляторных пептидов), снижающих повышенную продукцию АФК, которая отмечается при ряде заболеваний, в том числе и органов урогенитальной системы.

Таким образом, проведенные исследования выявили способность некоторых регуляторных олигопептидов стимулировать подвижность сперматозоидов человека. Хотя механизм наблюдаемого эффекта остается пока неясным, полученные данные показывают перспективность использования пептидов в андрологической и репродуктивной практике, в клиниках вспомогательных репродуктивных технологий.

Резюме:

Актуальной задачей современной андрологии и репродукции человека является поиск агентов, способных повышать подвижность сперматозоидов, а также увеличивать их устойчивость к действию повреждающих факторов различной природы. Важной проблемой андрологии и репродукции человека остается сохранение параметров фертильности, в частности, подвижности и жизнеспособности сперматозоидов.

Целью предпринятой работы явилось проведение изучения некоторых регуляторных олигопептидов, влияющих на подвижность сперматозоидов человека (семакс, селанк, pro-gly-pro, arg-pro-gly-pro, arg-glu-arg-pro-gly-pro, phe-gly-gly-phe-val-gly-pro). Материалом для опытов служил эякулят мужчин с патоспермией в форме асте-нозооспермии. Опыты с пептидами проводили при комнатной температуре. Концентрация регуляторных пептидов во всех примерах составляла 1000 мкг/мл эякулята. В случае пептида семакса использовали 2 концентрации: 10 и 1000 мкг/мл эякулята. Действие пептида семакса через 1 час инкубации приводило к существенному повышению активной подвижности (в 3-5 раз) и в меньшей степени – общей подвижности. Повышающий эффект зависел от концентрации пептида. Влияние пептида селанка было выражено менее значительно, не более 30 – 43%. Воздействие других исследуемых пептидов на подвижность сперматозоидов приводило к кратковременному эффекту: повышение подвижности сперматозоидов наблюдали в течение первых 30 минут. Через 1 и 3 часа инкубации подвижность сперматозоидов приближалась к контрольному уровню.

Механизм подобного действия остается неясным, однако, полученные результаты показывают перспективность использования пептидов в андрологической и репродуктивной практике.