Влияние регуляторов роста на размножение гибридных сортов княженики in vitro

Введение. На сегодняшний день возрастает интерес к малораспространеным культурам с высоким содержанием биологически активных веществ и уникальными вкусовыми качествами. Одной из таких культур является княженика ( Rubus arcticus L.).

R. arcticus представляет собой невысокое, до 30 см, многолетнее растение с тонким ползучим корневищем, образующим выводковые почки. Княженика цветет в июне-июле розовыми цветками. Плоды, темно-пурпурные, похожие на малину, созревают в июле-сентябре. Ареал княженики простирается в субарктическом поясе Евразии и Северной Америки [1].

Отличительной особенностью R. arcticus является вкус и аромат плодов, который обусловлен комбинацией из более 60 различных ароматических соединений [2]. Содержащиеся в листьях флавоноиды и сапонины, а в плодах производные фурана, фенолы и антоцианы, и другие биологически активные вещества оказывают противовоспалительное и радиопротектерное действие [3]. Таким образом, растение R. Arcti-cus является ценным сырьем не только для изготовления продуктов питания и виноделия, но и для фармацевтического производства.

Княженику можно использовать и как декоративную культуру. В естественных условиях произрастания встречаются экземпляры с махровыми светло-лиловыми цветками, которые можно использовать как цветовой акцент в альпийских горках и рокариях. Растение подходит для моновидовых композиций [4].

Несмотря на большое число хозяйственно ценных качеств , промышленные насаждения R. arctica немногочисленны и расположены, преимущественно, в странах Северной Европы. Возможно, это связано с низкой урожайностью и прихотливостью растения вначале введения в культуру. Mespi и Mesma были первыми культиварами, полученными в Финляндии на основе R. arctica . Последующее скрещивание R. arctica с R. arcticus subsp. stellatus (Sm.) B. Boivin позволило создать сорта с большим размером плодов, но все еще уступающих по урожайности другим представителям рода Rubus . Селекция R. arctica ведется и в России. Так, Д.Н. Зонтиковым и другими предложена методика получения гаплоидных растений R. arcticus для последующего создания гибридных линий [5, 6].

Традиционные способы вегетативного размножения княженики не способны удовлетворить повышающийся спрос на посадочный материал. Кроме этого, плантациям R. arcticus свойственно быстро истощаться: через 3–4 года урожайность культуры резко снижается, а осушение ее естес- твенных мест обитания и вытаптывание лесных угодий способствуют постепенному исчезновению княженики из дикой природы [7].

Таким образом, разработка протоколов клонального размножения in vitro княженики, позволяющих получать в относительно короткое время большое количество генетически однородного, оздоровленного посадочного материала становится важной для промышленного производства [8].

Некоторые особенности культивирования R. arcticus in vitro были изучены зарубежными и отечественными учеными. В исследованиях Harri I. Kokko и др. успешно размножали R. Arcti-cus и R. saxatilis на питательной среде с добавлением 6-бензиламинопурина в концентрации 1,5 мг/л [9]. Этапы собственно клонального микроразмножения и укоренения описаны в работах С.С. Макарова и Д.Н. Зонтикова [10, 11]. Однако данные по оптимальным регуляторам роста для культивирования R. arcticus in vitro не однозначны, что делает актуальным дальнейшее совершенствование протокола клонального микроразмножения княженики.

Цель исследования – усовершенствование технологии клонального микроразмножения княженики для массового получения посадочного материала.

Объекты и методы. Исследования проводили в 2023–2024 гг. в лаборатории биотехнологии растений ГБС РАН. В качестве объектов исследования использованы сорта, относящиеся к гибридам R. Arcticus × R. arcticus subsp. stellatus : Beata, Sofia, Anna и Astra.

На этапе собственно микроразмножения применяли минеральную основу питательной среды Murashige and Skoog (MS).

В первом опыте проводили сравнение различных концентраций 6-БАП: 0,3; 0,5; 1,0 мг/л и безгормональной питательной среды в качестве контрольного варианта.

Во втором опыте оценивали действие различных цитокининов (6-БАП, тидиазурон (ТДЗ), метатополин (мТ)) и их сочетаний в концентрации 1,0 мг/л на морфогенез сортов княженики in vitro . Через 45 дней учитывали высоту микропобегов, число микропобегов и коэффициент размножения. Коэффициент размножения рассчитывали, как произведение среднего числа эксплантов, полученных с одного микропобега, и числа микропобегов, образованных у одного эк-планта.

На этапе укоренения микропобеги княженики высаживали на питательную среду 1/2 MS с добавлением 20 г/л сахарозы. В исследовании анализировали влияние ИУК и ИМК в концентрациях 0,3 мг/л и 0,5 мг/л на укореняемость микропобегов.

Экспланты культивировали при температуре (23 ± 2) °С, фотопериоде 16/8 и освещенности 2000 лк. Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ SPSS Statistics 23. Для сравнения средних величин и установления статистически значимые различий применяли множественный ранговый критерий Дункана. Варианты опыта, отмеченные одинаковыми буквами, не имеют статистических различий при p < 0,05.

Результаты и обсуждение. Рост и развитие тканей растения на этапе собственно микроразмножения зависит от выбора оптимальных регуляторов роста и их концентрации [12]. При культивировании in vitro наиболее часто используют 6-БАП. В ходе изучении влияния концентраций 6-БАП на биометрические показатели эксплантов княженики, статистически значимые различия выявлены только по числу микропобегов (рис. 1).

Рис. 1. Влияние концентраций 6-БАП на число микропобегов княженики в культуре in vitro (различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05)

В ходе дисперсионного анализа установлено существенное различие по числу микропобегов между контрольным вариантом опыта и вариантами с добавлением 6-БАП в различных концентрациях в состав питательной среды. Однако, экспланты, культивируемые на питательных средах с различной концентрацией 6-БАП, статистически не различались по данному показателю. Использование 6-БАП стимулировало образование адвентивных микропобегов при любой концентрации, максимальное число микропобегов получено на питательной среде с добавлением 1,0 мг/л 6-БАП и составило 2,93 шт. При культивировании на питательной среде без добавления 6-БАП экспланты княженики образовывали минимальное число микропобегов – 1,45 шт. Это согласуется с работами других ученых. Для некоторых представителей рода Rubus оптимальной является концентрация в питательной среде 6-БАП в пределах от 0,5 до 1,5 мг/л [13]. Для дальнейшего изучения влияния источников цитокинина на размножение княженики in vitro выбрана концентрация 1,0 мг/л.

Некоторые исследователи отмечали положительный эффект при совместном использовании в питательной среде на этапе микроразмножения двух источников цитокинина [14]. В ходе опыта установлены существенные различия по высоте, числу микропобегов и коэффициенту размножения княженики, при использовании различных цитокининов и их сочетаний (табл.).

Влияние различных цитокининов и их сочетаний на биометрические показатели эксплантов княженики

Источник цитокинина*	Высота микропобегов, мм	Число микропобегов, шт.	Коэффициент размножения
6-БАП	19,44±0,83а	2,56±0,73e	11,11±2,91g
ТДЗ	14,16±1,07с	2,70±0,38e	12,63±1,63fg
мТ	18,06±0,97ab	2,12±0,34e	10,29±0,69g
6-БАП+мТ	18,05±0,73ab	2,00±0,28e	10,80±1,14g
6-БАП+ТДЗ	13,33±1,67c	4,33±0,88d	14,33±0,84f
мТ+ТДЗ	15,85±0,90bc	3,11±0,45de	12,33±1,64fg

*Концентрация каждого регулятора роста в варианте – 1,0 мг/л. Различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05.

Однофакторный дисперсионный анализ показал существенные различия по биометрическим показателям эксплантов княженики при использовании различных источников цитокинина в составе питательной среды. При культивировании на питательной среде, содержащей 1,0 мг/л 6-БАП совместно с 1,0 мг/л ТДЗ, выявлено наибольшее число микропобегов (4,33 ± 0,88 шт.) и максимальный коэффициент размножения (14,33 ± 0,84). Стоит отметить снижение высоты микропобегов при культивировании на питательных средах с добавлением ТДЗ, высота микрокропобегов варьировала в пределах от 13,33 до 14,6 мм. Схожие результаты были получены Н.В. Соловых при культивировании малины душистой: ТДЗ способствовал снижению высоты микропобегов [15]. Применение мТ при клональном микроразмножении княженики оказался малоэффективен, но может быть при- менен совместно с другими цитокининами, так как способствовал увеличению высоты микропобегов.

Этап укоренения важен для последующего культивирования регенерантов в условиях ex vitro. Двухфакторный дисперсионный анализ показал достоверное влияние генотипа и источника ауксина на укореняемость микропобегов различных сортов княженики. Сорта княженики различались по способности к корнеобразова-нию (рис. 2).

Наибольшим процентом укоренившихся микропобегов характеризовался сорт Sofia (77 %), минимальным – сорта Beata и Anna (62 и 65 % соответственно). Сорт Astra занимал промежуточное значение – 72 %.

В нашем исследовании укореняемость микропобегов княженики зависела от применяемого ауксина и его концентрации (рис. 3).

Рис. 2. Влияние генотипа на укореняемость микропобегов княженики (различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05)

Рис. 3. Влияние концентрации регуляторов роста на укореняемость княженики in vitro (различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05)

В исследовании установлены существенные различия по укореняемости микропобегов княженики на питательных средах с 0,3 мг/л и 0,5 мг/л ИУК. В свою очередь, укореняемость эксплантов при использовании 0,3 и 0,5 мг/л ИМК статистически не различалась. Максимальная укореняемость микропобегов отмечена при культивировании микропобегов на питательной среде с 0,5 мг/л ИУК (82 %). Культивирование сортов княженики на питательных средах с добавлением ИМК в различных концентрациях не оказало значительного влияния на образование корней у микропобегов: укореняе-мость составила 56–61 %. Таким образом, использование 0,5 мг/л ИУК для укоренения сортов княженики повышает эффективность метода клонального микроразмножения.

Заключение . В ходе исследования был оптимизирован протокол культивирования in vitro сортов Rubus arcticus. На этапе собственно микроразмножения оптимально использование питательной среды, сочетающей 6-БАП и ТДЗ в концентрациях 1,0 мг/л.

Укореняемость сортов княженики зависит от генотипа и концентрации регулятора роста в питательной среде. Наибольшим процентом укоренившихся микропобегов характеризовался сорт Sofia, оптимальным ауксином на этапе укоренения является ИУК в концентрации 0,5 мг/л.