Влияние рекомбинантного колицина Е2 на некоторые гериатрические показатели белых мышей в возрасте 1,5-2 лет

Продуктивное долголетие молочных коров остается важной проблемой в животноводстве. Животные могут сохранять высокую продуктивность в течение 8-9 лактаций, но в реальности этот период снижен в два раза [1]. С началом лактации высокопродуктивные дойные коровы подвергаются метаболическому стрессу, связанному с ним изменению длины теломер, цитокинового статуса и других маркеров старения [2]. С возрастом эти процессы усиливаются.

В связи с этим, исследование действия препаратов способных влиять на физиологические функции и гериатрические показатели пожилых животных представляет определенный интерес [3].

Целью работы явилось изучение действия рекомбинантного колицина Е2 (RecColE2) на некоторые гериатрические показатели пожилых белых беспородных мышей.

Материалы и методы

Исследование проводили на белых беспородных мышах-самцах в возрасте от 1,5 до 2-х лет весом 25-27 г. Были сформированы две группы мышей по 10 голов в группе. Животных содержали при естественном режиме освещения и свободном доступе к воде и пище. Эксперименты выполняли в соответствие с международными рекомендациями Европейской конвен- ции о защите позвоночных животных для исследований от 18 марта 1986 года.

Мышей контрольной (интактной) группы не подвергали манипуляциям. Мышам подопытной группы вводили RecColE2 в дозе 0,25 мл (25 мкг) подкожно первый месяц один раз в неделю и последующие 11 месяцев два раза в месяц [4, 5].

У животных проводили исследование крови на 1-е и 365-е сутки эксперимента. Длину теломер Т-хелперов CD4+ периферической крови в качестве маркера процесса старения и физиологического состояния организма определяли методом Flowfish гибридизации in situ с анализом на проточном цитофлуориметре Facs Calibur (Becton Dickinson) [6]. Количество цитокинов интерлейкина-4 (Il-4) и интерлейкина-12 (Il-12), фактора некроза опухолей альфа (TNF-α) и простагландина Е2 (PG E2) определяли методом иммунофермент-ного анализа (ИФА) диагностикумами Clon Cloud Co (США) и Cusabio Biotech Co (Китай) на ИФА-анализаторе Zenyth (Athos).

В последний день опыта мышей усыпляли декапитацией. За час до забоя мышам вводили колхицин в дозе 4,5 мкг/г массы тела внутрибрюшинно. Суспензию клеток костного мозга, полученную из бедренных костей, русуспендировали в растворе Хен-кса, центрифугировали при 1000 об./мин.

10 мин., удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 0,075М растворе хлорида калия в течение 25 минут при 370С, затем центрифугировали и удаляли супернатант. К осадку добавляли холодную (-300С) смесь этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Суспензию помещали на 30 мин. в холодильник при -400С, затем ресуспендирова-ли, центрифугировали и удаляли супернатант. Клетки ресуспендировали и отмывали фиксаторм. Затем удаляли супернатант и 0,5 мл клеточной взвести фиксировали в смеси этанола и ледяной кислоты в течение 20 мин., после чего наносили каплями на охлажденные предметные стекла. После окраски азур-эозином, метафазы анализировали на появление хромосомных аберраций. Анализировали по 100 метафаз от каждого животного.

Учитывали число одиночных и парных фрагментов, изменения структуры (деле-ции, инверсии, транслокации), ахроматических пробелов (гепов), число клеток с множественными повреждениями хромосом.

Статистическая обработка данных выполнена стандартными методами в программе «Statistica-5,0» [7].

Результаты и обсуждения

При исследовании длины теломер в лимфоцитах CD4+ в периферической крови мышей в возрасте 1,5-2-х лет по окончанию опыта установлено укорочение длины теломер в контрольной (интактной) группе с 18,25±0,14 до 10,68±0,62 тыс.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). В подопытной группе не отмечали снижение длины теломер. Теломеры позвоночных представляют собой специализированные концевые структуры хромосом, состоящие из тандемных повторов TTAGGG и функционирующих для защиты хромосом от слияния, рекомбинации и деградации. Укорочение теломер инициировало процесс апоптоза клеток и было связано с сокращением продолжительности жизни и состоянием здоровья организма [8]. Снижение длины теломер лимфоцитов CD4+ у животных контрольной группы отражало уровень возрастной иммуносупрессии, уменьшение пролиферативной и фагоцитарной активности популяции Т-хелперов в периферической крови. В контрольной группе пожилых мышей отмечали некоторое повышение в крови количества PG E2 – основного медиатора воспалительного ответа, влияющего на усиление отёка, лейкоцитарной инфильтрации, бронхострикции, тромбо-образования и ингибирования глицинерги-ческой нейротрансмиссии спинного мозга [9]. В группе подопытных животных количество PG E2 достоверно снижалось (таблица).

Таблица. Влияние RecColE2 на некоторые гериатрические показатели белых мышей в возрасте 1,5-2-х лет.

* P<0,05 – по отношению к 1-м суткам исследования;

** P<0,05 – по отношению к контрольной группе на 365-е сутки.

В крови мышей подопытной группы констатировали повышение IL-4 – ключе- вого ингибитора противовоспалительных цитокинов и активатора гуморального им- мунитета. Также отмечали повышение IL-12 и TNF-α – цитокинов, стимулирующих естественные киллеры и активаторы цитотоксических Т-лимфоцитов, вызывающих некроз опухолевых клеток и клеток, поражённых вирусами [10]. В контрольной группе не наблюдали повышения в крови количества противовоспалительных цитокинов (таблица).

Число клеток костного мозга с повреждениями хромосом у мышей подопытной группы не превышало 0,65±0,07%, что намного ниже максимальной спонтанной частоты аберраций (2,5%) у лабораторных белых мышей. В контрольной группе число аберраций клеток костного мозга до- стигало 3,1±0,05%, что подтверждает снижение длины теломер и повышение уровня провоспалительных цитокинов в крови.

Заключение

У белых мышей в возрасте 1,5-2-х лет контрольной группы отмечали укорочение теломер, изменение количества цитокинов в крови и повышение числа клеток костного мозга с хромосомными изменениями. В группе мышей после применения инъекционного курса RecColE2 констатировали стабильность количественных гериатрических показателей, снижение иммунодефицитных состояний и старческих фатальных мутаций.