Влияние режима пастеризации на полипептидный состав молока

В настоящее время возрастает роль традиционных продуктов питания человека и животных, характеризующихся высокой биологической ценностью. Одним из таких важных продуктов питания является молоко, биохимия и технологическая переработка которого активно и давно изучается с получением все новых данных (например, монографии [1,2]). Однако в процессе тепловой обработки молока, являющейся обязательной технологической операцией на молокоперерабатывающих заводах, возможно протекание деструктивных процессов, приводящих к снижению биологической ценности молока. Поэтому возрастает актуальность исследований в области изучения изменения биологической ценности молока при его термообработке [1].

Цель работы заключалась в изучении изменения полипептидного состава молока при 4 промышленных режимах пастеризации.

Материалы и методы. Объектом исследования являлось коровье и козье молоко. Для получения информации по изменению полипептидного состава были проведены исследования серии проб молока 10 коров и 9 коз в двукратной повторности. 4 промышленных режимах пастеризации: 65 0С, 30 мин.; 76 0С, 5 мин.; 90 0С, 20 сек.; 95 0С, 5 мин. Изменение полипептидного спектра молока до и после термообработки исследовалось с помощью одномерного и двумерного электрофореза. Белок молока осаждали ледяным ацетоном (1:1) с последующим центрифугированием в течение 10 мин. при 14000 об/мин. Одномерный электрофорез (1DE) осуществляли согласно Леммли [3], в градиентном (6-16%) полиакриламидном геле (ПААГ), для чего белок растворяли в sample-буфере с рН 8.0 (0,01 М Трис, 25% ДСН, 20 мМ ДТТ, 0,001 М ЭДТА, 25% глицерин, 1% бромфеноловый синий). Количество белка, нанесенного на трек, составляло 80 мкг. Двумерный электрофорез (2DE) в первом направлении (изоэлектрофокусирование) проводили с помощью самостоятельно изготовленных гелей (4% акриламид, 0,1% бисакриламид, 8 М мочевина, 1% амфолита, 2% ХАПС) в стеклянных трубочках (Bio-Rad) размером 1,0×180,0 мм. В качестве верхнего электродного буфера использовали 50 мМ NaOH, нижнего - 20 мМ Н3PO4. Для 2DЕ белок растворяли в ИЭФ-буфере (8 М мочевина; 2 М тиомочевина; 2% ХАПС; 0.2% амфолита рН 3-10; 30 мМ ДТТ и 20 мМ Tрис). Пробы фокусировали по следующей программе: 1 час при 100 В, 1 час при 200 В, далее каждый час повышали напряжение на 100 В до достижения 700 В (напряжение постоянное; сила тока не должна превышать 0,7 мА). Затем гели выдерживали 15 мин. в уравновешивающем буфере (6 М мочевина; 2% ДСН; 30% глицерин; 50 мМ Трис-HCl; следы бромфенолового синего и 2% ДТТ) и накладывали на 2D-мини-гель (6-16% ПААГ). 2DЕ проводили с использованием электродного буфера, содержащего 25 мМ Tрис-HCl; 192 мМ глицина и 0,1% ДСН, при силе тока 5 мА на 1 гель в течение 20 мин, затем при 10 мА в течение 120-150 мин. Для визуализации белков гели окрашивали 0,1% спиртовым раствором Кумасси R-250 в течение 10 мин., затем отмывали 50% этанолом (для 1DE). В ряде случаев белки дополнительно перед помещением в раствор Кумасси R-250 окрашивали раствором солей серебра (для 2DE). Гели сканировали при помощи Epson Perfection 3170 Photo, обработку данных проводили с помощью программ Scion Image (Великобритания) и Flicker (http://open2dprot.sourceforge.net\Flicker) (США).

Результаты и обсуждение. Тепловая обработка при различных режимах изменяла спектры полипептидов (ПП) как коровьего, так и козьего молока (рисунок 1 на примере одного донора каждого вида сельскохозяйственного животного).

• 1.    Влияние режимов пастеризации на спектры полипептидов коровьего (а) и козьего (б) молока: 1 – исходное молоко; 2 - 65 ⁰С, 30 мин.; 2 – 76 ⁰С, 5 мин.; 3 – 90 ⁰С, 20 сек.; 4 – 95 ⁰С, 5 мин. Нагрузка белка на трек 80 мкг

• 2.    Влияние промышленных режимов пастеризации на ПП состав молока (нагрузка: для коровьего 690 мкг ПП на гель, для козьего 450 мкг): а) коровье молоко (контроль);      б) козье молоко (контроль);

Данные рисунка 1 свидетельствуют, что изменения при пастеризации молока обоих видов наблюдаются в основном у двух полос ПП: 58,00 кДа и 100,50 кДа. При режиме термообработки 65 0С, 30 мин. как в коровьем, так и в козьем молоке содержание ПП 58,00 кДа оставалось практически неизменным. Повышение температуры пастеризации приводило к существенному изменению спектра ПП фракций обоих видов молока, особенно в области полосы 100,50 кДа, что свидетельствует о деструкционных процессах в молоке при его термообработке. Различия в изменении спектров ПП козьего и коровьего молока наблюдались уже при режиме термообработки 76 0С, 5 мин.: в козьем молоке – полная деградация ПП 100,50 кДа, тогда как в коровьем ПП 100,50 кДа сохраняется. При повышении температуры пастеризации до 95 0С при выдержке 5 мин. ПП 100,50 кДа исчезал, одновременно содержание ПП 58,00 кДа в коровьем молоке повышалось в среднем в 7 раз, а в козьем молоке повышалось лишь на 64 %.

Более детальное исследование ПП молока проведено методом 2DE. Спектры полипептидов нативного и термообработанного коровьего и козьего молока, разделенных методом 2DЕ, приведены на рисунке 2 (в качестве примера для одного донора каждого вида сельскохозяйственного животного) для режимов 65 0С, 30 мин.; 76 0С, 5 мин.; 90 0С, 20 сек.

Пастеризация коровьего молока при режиме 65 0С, 30 мин. (рисунок 2 в) вызывала исчезновение высокомолекулярных (выше 70 кДа) ПП как мажорных, так и минорных, за исключением некоторых минорных ПП с pI 5.0 – 7.0. В то же время появлялось много мажорных и минорных ПП с молекулярной массой 45-80 кДа в диапазоне pI 3.2-9.0. Кроме того, повышалось содержание низкомолекулярных мажорных ПП с молекулярной массой 12-36 кДа во всем диапазоне pI 3.0-9.5. Пастеризация козьего молока при режиме 65 0С, 30 мин. также вызывала исчезновение высокомолекулярных ПП, исключая ПП с pI 6.0 - 7.0. При данном режиме пастеризации более высокое содержание низкомолекулярных ПП было характерно как для козьего молока (рисунок 2 г), так и для коровьего (рисунок 2 в) по сравнению с натуральным. Данные по разделению белков пастеризованного молока методом 2DE при других режимах 76 0С, 5 мин.; 90 0С, 20 сек.; 95 0С, 5 мин. выявили, что наименьшие изменения в спектре белков молока наблюдались при режиме пастеризации 76 0С, 5 мин. (рисунок 2 д, е). Следует заметить, что режим 90 0С, 20 сек. также приближался к оптимальному режиму пастеризации 76 0С, 5 мин. Выявленные нами значительные изменения спектров ПП, особенно минорных, при пастеризации коровьего и козьего молока, очевидно, вызвано разложением более высокомолекулярных ПП, высвобождением оболочечных белков жировых шариков, а также образованием гликозилированных форм ПП по разным аминокислотным остаткам и другими посттрансляционными модификациями [1, 4, 5].

• в) коровье молоко, 65 ⁰С, 30 мин.; г) коровье молоко, 65 ⁰С, 30 мин.;

3. Влияние режимов пастеризации (1 – 65 ⁰С, 30 мин.; 2 – 76 ⁰С, 5 мин.; 3 – 90 ⁰С, 20 сек.; 4 – 95 ⁰С, 5 мин.) на деструкцию полипептидов молока: -коровье молоко; - козье молоко. (Деструкция: количество разрушенных ПП в % от количества в нативном молоке).

д) коровье молоко, 76 0С, 5 мин.;    е) козье молоко, 76 0С, 5 мин.;

ж) коровье молоко, 90 0С, 20 сек.;    з) козье молоко, 90 0С, 20 сек.

Оценка количества полипептидов нативного и пастеризованного при различных режимах молока, по данным 2DE, показала, что при всех режимах пастеризации коровьего и козьего молока степень деструкции нативных ПП достигает 15-27% и 20-35% соответственно (рисунок 3). Большая степень деструкции козьего молока связана по данным литературы с его меньшей термоустойчивостью [6].

Заключение. При пастеризации в результате процессов де- и реструктурирования наблюдается перераспределение полипептидов в коровьем и козьем молоке, наиболее выраженное для фракций 58 и 100,5 кДа: практически исчезновение последней полосы и заметное укрупнение первой. В зависимости от условий тепловой обработки степень деструкции нативных ПП достигала 15-27% и 20-35% для коровьего и козьего молока. Режим, обеспечивающий максимально возможную сохранность ПП фракций молока, соответствует 76 ⁰С, 5 мин.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Горбатова К. К. Биохимия молока и молочных продуктов: учебник для вузов. 3-е изд., перераб. и доп. – СПб.: ГИОРД, 2003. – 320 с. 2. Зайцев С.Ю., Конопатов Ю.В. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические аспекты (2-е издание). С.-Петербург: Лань. 2005, 384 с. 3. Laemmli U.K. // Nature. – 1970. – V.227, №4. – P. 680. 4. Cavaletto M. // Bioactive Components of Milk. – 2008. – V.720. – P. 129-141. 5. Тиняков Г.Г. Микроструктура молока и молочных продуктов. – М.: Пищпромиздат, 1963. – 126 с. 6. Меркушева И.Н., Петриченко С.П.,

Кожухова М.А. // Известия вузов. Пищевая технология. – 2005. - №2-3 – С. 44-46.

ВЛИЯНИЕ РЕЖИМА ПАСТЕРИЗАЦИИ НА ПОЛИПЕПТИДНЫЙ СОСТАВ МОЛОКА

Балакирева Ю.В., Зайцев С.Ю., Каримова Ф.Г., Акулов А.Н., Ахмадуллина Ф.Ю.

Резюме

Исследовано влияние промышленных режимов пастеризации коровьего и козьего молока на изменение их полипептидного состава. Данные 1DE и 2DE свидетельствуют о меньшей термоустойчивости козьего молока в сравнении с коровьим. Наименьшее разрушение нативных ПП молока наблюдается при режиме пастеризации 76 0С, 5 мин.

INFLUENCE OF TREATMENT PASTEURIZATION TO POLYPEPTIDE COMPOSITION OF MILK

Balakireva J.V., Zaitsev C.Y., Karimova F.G., Akulov A.N., Ahmadullina F.U. Summary

The changes of the polypeptide compositions of cow and goat milk during pasteurizations were investigated. Some 1DE and 2DE data testified the less thermal stability of the goat milk in comparison to the cow milk. Minimal destruction of the native polypeptides of goat milk was occurred at 76 0C during 5 min. of pasteurizations.