Влияние стресс-факторов различной природы на экспрессию генов стресс-ответа у самцов Drosophila melanogaster

Автор: Перегудова Д.О., Шапошников М.В., Москалев А.А.

Журнал: Известия Коми научного центра УрО РАН @izvestia-komisc

Статья в выпуске: 2 (22), 2015 года.

Бесплатный доступ

У самцов Drosophila melanogaster проанализирован уровень экспрессии 8 генов стресс-ответа в результате воздействия 11 стресс-факторов разной модальности. Полученная экспериментальная модель вида in vivo может быть использована для решения задач биосенсирования и биоиндикации экотоксикантов в лабораторных условиях.

Стресс-ответ, репортерный белок gfp

Короткий адрес: https://sciup.org/14992750

IDR: 14992750

Текст научной статьи Влияние стресс-факторов различной природы на экспрессию генов стресс-ответа у самцов Drosophila melanogaster

Живые организмы – многоуровневая саморегулирующаяся система. В ответ на нарушение гомеостаза (стресс) возникает комплекс внутри организменных изменений, в том числе экспрессии генов, иммунных, электрофизиологических, гормональных реакций и др. Приспособленность организма определяется эффективностью ответа на внешние воздействия, являющиеся стрессовыми факторами, такими как голодание, обезвоживание, гипертермия и др. Целью настоящего исследования был анализ уровня активности генов стресс ответа, меченных репортерным белком GFP, в ответ на действие экстремальных условий среды и экотоксикантов на модели Drosophila melanogaster .

Материалы и методы

Линии Drosophila melanogaster

Defensin-GFP, Drosomycin-GFP, Metchnikowin-GFP – содержат GFP-репортеры генов антимикроб- ных пептидов, активируемых по Toll-зависимому сигнальному пути. D-GADD45-GFP – содержит GFP-репортер гена ответа на повреждение ДНК D-GADD45. GstD1-GFP – содержит GFP-репортер гена глутатион-S-трансферазы, отвечающей за детоксикацию ксенобиотиков. Hsp22-GFP и Hsp70-GFP – содержат GFP-репортеры генов белков теплового шока 70 и 22. Stat92E-GFP – содержит GFP-репортер транскрипционного активатора STAT92E, участвующего в регуляции общего стресс-ответа.

Оценка изменения экспрессии генов, меченных репортерным белком GFP

Экспрессию исследуемых генов оценивали путем регистрации изменения уровня флуоресценции репортерного белка GFP. Для этого пятидневных самцов Drosophila melanogaster исследуемых линий подвергали воздействиям стресс-факторов (табл. 1); на 1-, 2- и 3-е сут. после воздействия визуализировали уровень флуоресценции у анестезированных особей с помощью люминесцентного микроскопа «МИКМЕД-2 вар.11» («ЛОМО») и ви-

Таблица 1 Условия воздействий Воздействие Условия воздействия Время экспозиции, ч. Ссылка Гипергравитация Паракват Голодание Обезвоживание Гипертермия Холодовой стресс Диоксин Толуол Формальдегид 1.8, 16.1 G 1 [2] 5, 20 мМ 24 [3] Раствор 3 %-ной агарозы вместо питательной среды 16, 77 [4] Относительная влажность воздуха 30 % 16, 48 [5] 34 и 39°С 0.5 [1] 0°С и -4°С 2 [6, 7] 0.822 и 1.644 мкМоль/л 72 [8] 50 и 100 мкМоль/л 72 [9] Пары 7% и 14% формальдегида 24 [10] Смешанная биомасса монокультур бакте- Инфицирование путем Бактериальная инфекция рий Micrococcus luteus и Escherichia coli с содержа- прокола верхней части нием клеток не менее 103 или 109 КОЕ/мл груди при помощи тон- [11] кой иглы Культура грибка Beauveria bassiana. Грибковая инфекция Содержание спор на одну особь – не менее 101 и 3 мин [12] 102 КОЕ деосистемы на основе цифровой камеры Olympus C7070. Количественный и качественный анализы снимков проводили с помощью программы ImageJ 2x 2.1.4.7. Вычислялся коэффициент CTCF (Corrected total cell fluorescence) в пикселях. Статистическую обработку результатов выполнили с использованием t-критерия Стьюдента [1].

Обработка стрессовыми факторами

До воздействия мухи содержались на стандартной агарно-дрожжевой среде при температуре 25°С, относительной влажности 60% и 12-часовом режиме освещения. Во всех экспериментах использовали самцов Drosophila melanogaster соответствующей линии, которых в возрасте 5 сут. подвергали соответствующему воздействию (табл. 1).

Результаты и обсуждение

Показано, что репортеры генов антимикробных пептидов Defensin-GFP, Drosomycin-GFP, Met-chnikowin-GFP активируются в ответ на весь спектр исследованных факторов. Динамика экспрессии данных генов иммунного ответа различна и зависит от дозы и времени измерения: наблюдается как увеличение, так и снижение активности данных генов. Однако в случае бактериального и грибкового заражения наблюдается только увеличение экспрессии генов Defensin, Drosomycin и Metchnikowin (табл. 2).

Репортер гена ответа на повреждение ДНК D-GADD45-GFP активируется практически на все изучаемые воздействия. Активность D-GADD45-GFP снижается после воздействия голодания.

GFP-репортер гена глутатион-S-трансферазы GstD1-GFP , отвечающей за детоксикацию ксенобиотиков, активируется на бактериальное заражение, гипергравитацию, паракват, формальдегид, гипертермию. В то же время уровень экспрессии GstD1-GFP снижается при голодании, обезвоживании и обработке диоксином.

GFP-репортеры генов белков теплового шока 70 и 22 активируются на грибковую инфекцию, ги- пергравитацию, обезвоживание, диоксин, толуол, формальдегид, гипертермию, холодовой шок. Экспрессия Hsp22-GFP снижается в ответ на длительное голодание и формальдегид, а экспрессия Hsp70-GFP падает при длительном голодании.

Активность Stat92E-GFP , участвующего в регуляции общего стресс-ответа, снижается в ответ на бактериальное заражение, холодовой стресс и формальдегид, однако увеличивается в результате воздействия других стресс-факторов (табл. 2).

Анализ интенсивности экспрессии GFP-репортеров выявил, что время активации репортера зависит от типа фактора и от дозы воздействия. В ответ на такие факторы, как обезвоживание, диоксин, толуол, формальдегид уровень экспрессии GFP-репортеров увеличивается в течение 24 ч после воздействия. Однако бактериальное заражение, грибковая инфекция, гипергравитация, голодание, паракват, гипертермия, холодовой шок приводят к активации репортерного белка в течение 48 ч после воздействия. Чем выше интенсивность воздействия, тем быстрее происходит активация репор-терного белка. Однако в некоторых случаях после влияния большой дозы стресс-фактора наблюдается снижение экспрессии всех изучаемых генов, как, например, после длительного голодания (табл. 2).

Оценка временной динамики экспрессии GFP-репортеров показала, что продолжительность активности репортера также зависит от типа фактора и от дозы воздействия. При быстрой активации экспрессии в ответ на обезвоживание, диоксин, толуол, формальдегид ее уровень снижается через 72 ч после воздействия. При медленной активации экспрессии GFP-репортеров в ответ на бактериальное заражение, грибковую инфекцию, гипергравитацию, голодание, паракват, гипертермию, холодовой шок активации репортерного белка сохраняется дольше чем 72 ч после воздействия (табл.2).

Известно, что факторы окружающей природы физической, химической или биологической способны изменять транскрипционный профиль клетки

Таблица 2

	Воздействие	Гипергравитация, G		Паракват. mM	Обезво-Голодание, ч. жива-ние, %		Гипертермия, °С		^{Холодовой} Диоксин, мкМоль/л стресс, °С		Толуол, мкМоль/л ^{Формальде}гид, %			Бактериальная Грибковая ин-^инК^фО^еЕ^к/^цм^ил^я, фекция, КОЕ
	Доза Время	1.8	16.1	5 20	16	48 30	34	39	0 -4 0.822	1.644	50	100 7	14	10^3	10^9 10^1	10^2
Cl	1 сутки	-	-4	- 11.22	-	-12 -	-	-	-11 - 10.32	10.37	2.78	- 4.9	3.51	-	- -	-
	2 сутки	8.6	-	- -6.52	-	- -	-	38.2	31.9 33.7 -4.93	-4.06	4.06	8.54 -	-	-	4.39 -	-
	3 сутки	-6	-5	- -	-	-3 -	-	-10	-10 - -	2.76	-	- 4.6	5.64	4.75	7.65 5.29	-
Cl	1 сутки	-	-	- -8.71	-	- -	-	-	-6 -5.7 3.32	6.54	6.09	8.48 -	-	70.47	144 -	7.65
	2 сутки	-	-	- -6.44	3.4	-9 -	-	34	9.47 - 6.38	9.15	4.85	5.64 -	-	63.95	211 -	-
	3 сутки	-	-	- -	-	-12 -	-	-	-12 - -	-	-	- -	-3.8	43.82	231 -5.17	7.11
	1 сутки	-	-	- -	2.51	- 14.67	-	-	- - -	-	-	- -	-	-	- -	-
	2 сутки	-	-	- -	3.81	- 7.99	-	-8.6	7.37 10.5 -	-	-	- -	-	10.23	10.3 3.8	4.31
	3 сутки	-	5.42	- -	-5	-10 7.56	-	-	-11 - -	-	-	- -	-	10.42	8.82 -	20.49
	1 сутки	-	-	- -3.21	4.72	- -	6.63	-	8 - -	-	5.66	- -	-	-	5.63 -6.84	-
	2 сутки	-	-	4.8 -	-	-9 6.21	-	-	- - -6.26	-4.72	-2.7	- 7.74	5.35	7.15	11.84 10.87	12.03
	3 сутки	7	4.86	3.843 -	-17	-18 9.99	-	-	-8 - 9.12	6.44	4.55	5.77 -	-	3.07	11.24 -	-
	1 сутки	12.7	-	- 18.29	-9	-21 -20.27	8.33	-	- - -7.16	-	-	- 10	14.9	11.86	20.75 -	-
	2 сутки	-	-	26.74 29.09	-19	-30 -	-	105	-13 - -	-	-	- -	12.5	-	13.56 -	12.47
	3 сутки	-	-	- 23.73	-16	-36 -	-	-	-11 - -	-	-	- -	8.85	-1.09	7.73 -	-
	1 сутки	-	8.43	- -	-	-15 -	-	-	- 10.3 8.16	9.32	9.22	11.67 -7.4	-7.9	-	4.56 -	-
	2 сутки	-	-8	8.84 12.97	4.1	- 3.68	-	11.1	- 12.9 -	-3.08	-	- -	-7.2	9.26	10.71 -	-
	3 сутки	15.3	10.9	9.87 13.87	-	-5 6.43	-	-	-11 - -	5.17	3.43	3.43 -	-	-4.12	6.16 -	5.64
	1 сутки	-	4.75	- -	-	- 7.31	13	-	- 10.1 11.17	15.92	10.18	12.04 3.83	9.65	-	- -	5.81
	2 сутки	-	-	4.24 6.04	4.48	-3 9.23	-	42.4	4.62 4.52 17.49	19.66	11.59	13.48 -	-	6.85	8.19 4.48	3.69
	3 сутки	-	-	6.57 13.41	-7	-11 11.75	-	29	-11 - -	-	-	- 3.61	-	-	- -	3.44
	1 сутки	-	14.8	10.91 15.78	-	- -	-	-	- - -	-	-	- -	-	-	- -	-
	2 сутки	17	16.7	10.41 13.25	-	- -	-	12	-11 - -	-	-	- -	-	-	-9.44 -	-
	3 сутки	-	-	13 20.72	-	- -	9.81	8.77	-16 -8.7 -	-	-	- -9.8	-11	-8.58	- -	20.49

Изменение экспрессии изучаемых генов после воздействия стресс-факторов различной природы

Примечание: «–» - изменения отсутствуют. В таблице указаны достоверные изменения экспрессии в процентах (t-критерий Стьюдента, р <0.05).

и влиять на активность генов клеточного стресс-ответа, именно этот механизм лежит в основе стресс-ответа организма в целом [13]. Несмотря на то, что основные механизмы стресс-ответа консервативны как в разных группах организмов, так и при воздействии факторов различной природы [14], те или иные стресс-факторы могут оказывать специфическое действие. В данной работе нами показано, что, несмотря на то, что практически все изученные гены изменяют свою экспрессию на весь спектр выбранных воздействий, время активации того или иного гена зависит от типа и интенсивности воздействия. Кроме того, увеличение интенсивности воздействия может приводить к снижению активности генов стресс-ответа, как, например, в случае длительного голодания. К специфическому действию изучаемых стресс-факторов также можно отнести длительность наблюдаемых изменений.

Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации № МД-1090.2014.4 и грантом РФФИ № 14-04-01596.

Список литературы Влияние стресс-факторов различной природы на экспрессию генов стресс-ответа у самцов Drosophila melanogaster

Yang J. and J. Tower Expression of hsp22 and hsp70 transgenes is partially predictive of drosophila survival under normal and stress conditions//J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2009. T.64. №8. P. 828-38.
van Loon J.J., E.H. Folgering, C.V. Bouten, J.P. Veldhuijzen, and T.H. Smit Inertial shear forces and the use of centrifuges in gravity research. What is the proper control?//J Biomech Eng. 2003. T.125. №3. P. 342-6.
Hosamani R. Acute exposure of Drosophila melanogaster to paraquat causes oxidative stress and mitochondrial dysfunction//Arch Insect Biochem Physiol. 2013. T.83. №1. P. 25-40.
Wit J., P. Sarup, N. Lupsa, H. Malte, J. Frydenberg, and V. Loeschcke Longevity for free? Increased reproduction with limited trade-offs in Drosophila melanogaster selected for increased life span//Exp Gerontol. 2013. T.48. №3. P. 349-57.
Marron M.T., T.A. Markow, K.J. Kain, and A.G. Gibbs Effects of starvation and desiccation on energy metabolism in desert and mesic Drosophila//J Insect Physiol. 2003. T.49. №3. P. 261-70.
Arias L.N., P. Sambucetti, A.C. Scannapieco, V. Loeschcke, and F.M. Norry Survival of heat stress with and without heat hardening in Drosophila melanogaster: interactions with larval density//J Exp Biol. 2012. T.215. №Pt 13. P. 2220-5.
Boher F., N. Trefault, M.D. Piulachs, X. Belles, R. Godoy-Herrera, and F. Bozinovic Biogeographic origin and thermal acclimation interact to determine survival and hsp90 expression in Drosophila species submitted to thermal stress//Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2012. T.162. №4. P. 391-6.
Bigelow S.W., J.A. Zijlstra, E.W. Vogel, and D.W. Nebert Measurements of the cytosolic Ah receptor among four strains of Drosophila melanogaster//Arch Toxicol. 1985. T.56. №4. P. 219-25.
Singh M.P., M. Mishra, A. Sharma, A.K. Shukla, M.K. Mudiam, D.K. Patel, K.R. Ram, and D.K. Chowdhuri Genotoxicity and apoptosis in Drosophila melanogaster exposed to benzene, toluene and xylene: attenuation by quercetin and curcumin//Toxicol Appl Pharmacol. 2011. T.253. №1. P. 14-30.
Stumm-Tegethoff B.F. Formaldehyde-induced mutations in Drosophila melanogaster in dependence of the presence of acids//Theor Appl Genet. 1969. T.39. №7. P. 330-4.
Bulet P., J.L. Dimarcq, C. Hetru, M. Lagueux, M. Charlet, G. Hegy, A. Van Dorsselaer, and J.A. Hoffmann A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution//J Biol Chem. 1993. T.268. №20. P. 14893-7.
Lemaitre B., J.M. Reichhart, and J.A. Hoffmann Drosophila host defense: differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganisms//Proc Natl Acad Sci U S A. 1997. T.94. №26. P. 14614-9.
Moskalev A., M. Shaposhnikov, A. Snezhkina, V. Kogan, E. Plyusnina, D. Peregudova, N. Melnikova, L. Uroshlev, S. Mylnikov, A. Dmitriev, S. Plusnin, P. Fedichev, and A. Kudryavtseva Mining gene expression data for pollutants (dioxin, toluene, formaldehyde) and low dose of gamma-irradiation//PLoS One. 2014. T.9. №1. P. e86051.
de Nadal E., G. Ammerer, and F. Posas Controlling gene expression in response to stress//Nat Rev Genet. 2011. T.12. №12. P. 833-45.

Еще

Статья научная