Влияние сульфата меди на морфологические показатели и активность каталаз сои после инокуляции Bradyrhizobium japonicum и Sinorhizobium fredii

Введение. В настоящее время сельскохозяйственное производство становится все более зависимым от экологических факторов антропогенного происхождения, которые в значительной степени изменяют свойства почвы, продуктивность растений и качество продукции [1]. Считают, что из всего комплекса загрязнителей окружающей среды наиболее опасными являются тяжелые металлы (ТМ), которые способны накапливаться в почве, растениях и, естественно, продуктах питания человека [2; 3; 4; 5]. Они могут поступать с отходами промышленности, из атмосферы, со сточными водами, выбросами транспорта, минеральными удобрениями, пестицидами [6; 7].

Многочисленные публикации свидетельствуют о том, что одним из основных загрязнителей является медь [8; 9; 10].

Амурская область является северным ареалом произрастания дикорастущей сои, которая в результате эволюции вступила в симбиотические отношения с определенным видом почвенных бактерий (ризобий сои) [11]. Роль клубеньковых бактерий не ограничивается только удовлетворением потребности растений в азоте. Клубеньковые бактерии синтезируют вещества, способные убивать или задерживать рост возбудителей различных болезней культурных растений [12].

В связи со сложными метеоусловиями региона востребованы сорта с высокими адаптивными показателями, способные продуктивно взаимодействовать со специфическими для сои клубеньковыми бактериями.

Ранее нами проведено исследование по влиянию ТМ на РНКазную активность проростков сои после инокуляции ризо-биями сои [13].

Соя имеет большой ареал обитания и ее приспособленность к окислительному стрессу, который создают ТМ, зависит от активности ферментов, особенно антиоксидантного комплекса, в состав которого входит фермент каталаза (К.Ф.1.11.1.6.). Это двухкомпонентный фермент, содержащий четыре гема, каждый из которых прочно связан с белком. Роль каталазы состоит в том, что она защищает организм от вредного влияния пероксида водорода, образующегося при дыхании.

Цель работы ‒ изучить влияние сульфата меди на морфологические показатели и активность каталаз сои после ее инокуляции Bradyrhizobium japonicum и Sinorhizobium fredii.

Материалы и методы. Объектом исследования служил сорт сои Гармония (Glycine max (L.) Merrill), полученный из ФГБНУ ВНИИ сои. Использовали коллекционные штаммы бактерий ризобий сои селекции ВНИИ сои – Bradyrhizobium japonicum (Kircher, 1986) Jordan и Sinorhizobium fredii (Scholla and Elkan, 1984). Нами использовались активные коллекционные штаммы БД-32 и 648а в качестве штаммов-стандартов по виду, на них получены авторские свидетельства, и перспективные штаммы ТБ-508 и ТА-125, депонированные во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино). Быстро- и медленнорастущие штаммы ризо-бий сои различаются по срокам появления колоний в чашках Петри на минерально-растительной среде, источникам углеводного питания, продуктам метаболизма, свойствам вирулентности и адаптационным возможностям [14].

Сою выращивали на питательной среде (К 2 НРО 4 – 1,0 г/л; MgSO 4 – l,0 г/л; СаSO 4 – 0,5 г/л; FeS0 4 – следы; Н 3 ВО 3 – следы; MnS0 4 – следы; (NH 4 ) 6 Mo 7 0 24 – следы), определяли способности клубеньковых бактерий образовывать клубеньки при температуре +26 ºС и относительной влажности 69 % по общепринятой методике в модификации Бегуна [15]. Освещенность измеряли при помощи люксметра Ю-116. Она составила 450 lx.

В эксперименте использовали соли серной кислоты, поскольку ионная сила действия солей проявляется в ряду СО 3 ^2->Cl^->SO 4 ^2-. К тому же в аэрозолях, поступающих от промышленных предприятий, тяжелые металлы присутствуют в виде сульфатов [16]. В опыте использовали раствор сульфата меди в концентрациях 6·10^-5 М; 6·10^-4 М и 3·10^-3 М. Контрольными были образцы, выращенные на питательной среде без добавления соли, без инокуляции штаммами ризобий сои, и растения сои, выращенные на питательной среде без добавления сульфата меди и инокуляции. Продолжительность опыта 16 дней, что соответствует появлению второго тройчатого листа.

Активность каталаз определяли газометрическим методом, содержание белка – по Лоури. Удельную активность выражали в единицах активности на миллиграмм белка. Электрофоретические спектры фермента определяли методом электрофореза в 7,5 %-ном ПААГ с последующим выявлением зон каталаз. Поскольку стандартным критерием для характеристики множественных форм ферментов является их относительная электрофоретическая подвижность (Rf), разнокачественность сортов сои оценива- ли по выявленным формам каталаз согласно их Rf. Нумерация форм проведена от более высокоподвижных к низкоподвижным. В ходе исследований впервые выявлено 13 форм каталаз проростков сои. Каждой форме каталазы было присвоено свое сокращенное обозначение в соответствии со значениями их Rf от К1 до К13.

Биохимические исследования проводили в двух биологических и трех аналитических повторностях. Дисперсионный анализ проводили в изложении Плохин-ского [17].

Вирулентность изучаемых штаммов ри-зобий сои определяли по наличию клубеньков на корнях сои в процентном отношении. Достоверность полученных данных проверяли по отсутствию клубеньков на корнях сои в контрольных пробирках без инокуляции.

Результаты и обсуждение. Ранее проведенный эксперимент показал, что внесение в питательную среду сульфата меди в концентрации 1 г/л оказывало угнетающее действие на сою по всем морфологическим показателям. Поэтому для дальнейших исследований использовали более низкие концентрации соли.

Анализ результатов показал положительное влияние CuSO 4 в концентрации 6·10^-4М на морфологические показатели сои по сравнению с контролем (таблица). При данной концентрации штаммы БД-32 и 648а образовали наибольшее количество клубеньков, причем вирулентность штамма 648а увеличилась в 1,5 раза.

Высокая концентрация сульфата меди (3·10-3М) оказала угнетающее действие на сою после инокуляции всеми исследованными штаммами. На сое, инокулированной штаммом ТБ-508, при внесении в питательную среду сульфата меди в концентрации 6·10-4М наблюдалось большое количество боковых корней, что впоследствии привело к снижению вирулентности, но данный факт не отразился на высоте растения. Следует отметить, что растения сои, семена которых инокулировали данным штаммом, обладали более высокими морфологическими показателями, и даже высокая концентрация соли

(3·10-3М) привела к незначительному уменьшению высоты сои по сравнению с контролем.

Таблица

Морфологические показатели сои и вирулентность выросших на питательной среде с добавлением сульфата меди различной концентрации после инокуляции семян бактериями ризобий сои

Штамм	Концентрация CuSO 4 , М
	0         1	6·10-5	6·10-4	3·10-3
	Вегетативная масса, балл
БД-32	4	4	4	3
ТБ-508	4	5	4	4
648а	4	3	4	4
ТА-125	4	4	4	4
Без инокуляции	4	4	5	4
НСР 05	1	1	1	1
	Высота растения, см
БД-32	20	16	16	11
ТБ-508	16	21	21	15
648а	19	15	22	15
ТА-125	21	14	20	16
Без инокуляции	19	19	25	15
НСР 05	3	3	3	4
	Длина корневой системы, см
БД-32	13	14	15	8
ТБ-508	12	16	14	9
648а	12	33	13	8
ТА-125	12	14	14	11
Без инокуляции	11	14	14	10
НСР 05	2	4	3	4
	Вирулентность, %
БД-32	43	37	60	22
ТБ-508	38	45	26	19
648а	48	40	71	25
ТА-125	49	19	37	24
Без инокуляции	0	0	0	0

Интересно, что при наступлении фазы первого и второго тройчатого листа большая часть растений сои, выросших на питательной среде с добавлением раствора исследуемой соли в концентрации 3·10-3М, отличились ломкостью.

Таким образом, в результате эксперимента установили, что высокая концентрация сульфата меди оказала угнетающее действие на морфологические показатели сои, инокулированной медленнорастущими штаммами (648а и ТА-125) и быстрорастущим штаммом БД-32, где показатели сои были ниже, чем у контроля.

Исследование влияния сульфата меди на удельную активность и множественные формы каталаз в контрольных образцах, без инокуляции, показало увеличение активности сои по сравнению с контролем 1К (рисунок А, Б).

Следует отметить, что при концентрации соли 3·10-3 М каталазная активность увеличилась в три раза, что, возможно, связано с усилением метаболических процессов. Однако гетерогенность каталаз сои в присутствии сульфата меди несколько снижалась, за исключением образцов, выращенных на питательной среде, содержащей соль в концентрации 6·10-4 М, где число множественных форм каталаз сохранилось на уровне контроля.

1К2КЗК4К 12 3 4 1 2 3 4   1 2 3 4 1 2 3 4

без инокуляции БД-32   ТБ-5О8 64Sa    ТА-125

Рисунок – Удельная активность (А)

и схемы энзимограмм (Б) каталаз сои на питательной среде с добавлением сульфата меди в концентрациях: 2 – 6·10-5 М; 3 – 6·10-4 М;

4 – 3·10-3 М; 1К, 2К, 3К, 4К – контроли (см. методику)

Удельная активность каталаз в контрольных образцах, инокулированных штаммами ризобий сои, незначительно снизилась по сравнению с контролем 1К. Отмечены значительные отличия по количеству множественных форм фермента. Инокуляция сои быстрорастущим штаммом БД-32 и медленнорастущими штаммами 648а и ТА-125 привела к увеличению количества форм каталаз. Инокуляция медленнорастущим штаммом 648а при наличии в питательной среде сульфата меди в концентрации 6·10-5 М привела к максимальному количеству множественных форм (12), а при повышенных ее концентрациях (6·10-4 М и 3·10-3 М) число форм значительно снизилось, что, вероятно, связано со снижением его адаптивных возможностей.

Выводы. Установлены характерные изменения удельной активности и спек- тра множественных форм каталаз сои в зависимости от концентрации сульфата меди и штаммов ризобий сои. Выявлено, что инокуляция быстрорастущими штаммами S. fredii ТБ-508 и БД-32 и медленнорастущим штаммом B. japonicum ТА-125 семян сои на питательной среде в присутствии исследуемой соли привела к увеличению или стабильности удельной активности каталаз сои по сравнению с контролем, что позволяет сделать вывод о повышенной адаптивности данных штаммов. Высокая концентрация сульфата меди привела к снижению количества множественных форм каталаз сои, что свидетельствует о значительном ее стрессе в данных условиях. Стабильная активность и стабильное число множественных форм для сои, инокулированных штаммом ТБ-508, соотносится с хорошими морфологическими показателями, что характеризует его высокие адаптивные возможности.

Таким образом, данный эксперимент подтверждает результаты исследований природных популяций ризобий, проведённых во Всероссийском НИИ сои, о том, что штаммы вида S. fredii более адаптивны по своей природе по сравнению с видом B. japonicum [18].

Показано, что изучение влияния сульфата меди различных концентраций и симбиоза сои с ризобиями на удельную активность и множественные формы каталаз позволяет прослеживать адаптивную реакцию сои и штаммов на молекулярном уровне.