Влияние термообработки молока на выявляемость провирусной ДНК ВЛКРС в ПЦР

Вирус лейкоза крупного рогатого скота ( ВЛКРС ) может находиться в соматических клетках , содержащихся в молозиве и молоке естественно зараженных животных . Установлено , что вирус чувствителен к температурным воздействиям и разрушается при повторных замораживаниях и оттаиваниях . Пастеризация молока разрушает его и он теряет инфекционность . Полная инактивация вируса в молоке или вируссодержащей жидкости достигается при 50⁰ С в течение 70 секунд ( Сюрин В . Н . и др ., 1986).

Ретровирусы , к семейству которых относится ВЛКРС , характеризуются наличием разных форм генетического материала : РНК в вирусных частицах , провирусная ДНК в ядре и цитоплазме , РНК - транскрипты в клетке . У инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота в В - лимфоцитах синтезируются десятки и сотни молекул провирусной ДНК , но только часть из них встраивается в геном клетки хозяина , а остальные выходят из клетки при её разрушении ( Сергеев В . А . и др ., 1983; Хазипов Н . З . и др ., 2008).

По нашим данным при исследовании методом ПЦР проб молока от инфицированных ВЛКРС коров до 30% случаев обнаруживается провирусная ДНК ВЛКРС . В зависимости от стадий развития болезни в 15% от исследованных проб провирусная ДНК выявляется в иммунных комплексах молока .

Выявление провирусной ДНК служит важным фактором контаминации молока вирусом лейкоза крупного рогатого скота .

Целью работы явилось определение влияния термической обработки молока в различных температурных режимах на выявляемость провирусной ДНК ВЛКРС полимеразной цепной реакцией .

Материалы и методы . Исследовали 36 проб молока от больных лейкозом коров из неблагополучных хозяйств РТ . ПЦР ставили с использованием реактивов тест - системы « Лейкоз КРС - провирус » для диагностики лейкоза крупного рогатого скота , ФГУН ЦНИИЭ – фирмы АмплиСенс , на обнаружение провирусной ДНК в лейкоцитах и циркулирующих иммунных комплексах ( ЦИК ) в молоке . ДНК из исследуемого материала выделяли используя набор реагентов тест - системы – « ДНК – сорб – В ». Электрофоретический анализ продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле , содержащем 5 мкл 10% бромистого этидия . Согласно временному наставлению по применению тест - системы , положительными считаются образцы , содержащие на электрофореграмме продуктов амплификации специфическую полосу на уровне 294 п . н .

Циркулирующие иммунные комплексы выделяли методом преципитации в полиэтиленгликоле ( ПЭГ ). Для этого пробы обезжиренного молока смешивали в соотношении 1:1 с 7% раствором ПЭГ -6000 в 0,1 М боратном буфере ( рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4 ^о С в течение 48 часов . Преципитат осаждали центрифугированием при 3000g в течение 20 минут и трижды промывали с десятикратным объемом 3,5% ПЭГ в боратном буфере .

Каждую пробу обезжиренного молока после тщательного перемешивания делили на 2 ровные части по 30 мл . Первую часть использовали для постановки ПЦР без предварительной обработки с ПЭГ .

Вторую часть обезжиренного молока использовали для выделения ЦИК . Полученный осадок иммунных комплексов растворяли в 1 мл физиологического раствора и также ставили реакцию полимеразной цепной реакции .

Результаты исследований . В 10 пробах нативного молока (28%) и в 12 пробах выделенных из него ЦИК (33%) обнаружили провирусную ДНК ВЛКРС . В 7 пробах молока провирусная ДНК выявлена как в соматических клетках , так и в ЦИК . Для дальнейших исследований использовали эти пробы .

Отобранные положительные пробы разливали в 3 стеклянные стаканчики в объеме по 10 мл и подвергли термической обработке в 3- х режимах :

• -    пастеризация в течение 30 мин при 70⁰ С ;

• -    кипячение - 5 мин ;

• -    кипячение - 10 мин ;

Все пробы исследовали методом ПЦР .

Во всех 7 пробах молока, подвергнутых пастеризации и в 5 пробах из 7 после 5 минутного кипячения, обнаруживали провирусную ДНК. Пробы молока, подвергнутые 10 минутному кипячению, были свободны от провирусной ДНК ВЛКРС. Однако, при исследовании поверхностных пленок, образовавшихся после кипячения этих проб, ПЦР-анализ показал положительные результаты.

1     2 3    4 5    6 7 8    9 10

294 п . н .

1. Электрофореграмма продуктов амплификации .

Обозначения : Треки : 1-4, 8 – пробы молока пастеризованные ; 5, 6, 9 – кипяченные 5 мин ; 7,10 – кипяченные 10 мин .

Роль циркулирующих иммунных комплексов в патогенезе ВЛКРС инфекции не изучена . Возможно , они формируются в процессе гибели инфицированных В - лимфоцитов путем соединения невстроенных в геном вирусных ДНК с поверхностными IgM, обладающими высокой аффинностью к ДНК . По нашим данным появляются они в более поздних стадиях болезни при выраженной вирусемии организма , когда животное становится потенциально опасным источником заражения стада . Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными . Поэтому при лейкозе крупного рогатого скота окончательная постановка диагноза может быть направлена на обнаружение ДНК вируса в ЦИК методом ПЦР . Особенно перспективным , в этом отношении , может стать обнаружение ДНК вируса в циркулирующих иммунных комплексах содержащихся в молоке .

Влияние генетического материала ВЛКРС , содержащегося в молоке , на организм человека мало изучено . Тем более мало известно о нативных свойствах провирусной ДНК после пастеризации и кипячения молока . Изучение структуры и свойств провирусной ДНК в молоке после термической обработки должно стать объектом дальнейших научных исследований для установления её инфекционности .

ЛИТЕРАТУРА . 1. Сюрин В . Н . Вирус лейкоза крупного рогатого скота / В . Н . Сюрин , Р . В . Белоусова , Н . В . Фомин . - М .: Агропромиздат , 1986. – С .76-85; 2. Сергеев В . А . Структура и биология вирусов животных / В . А . Сергеев , Б . Г . Орлянкин // М . « Колос ».- 1983.- с .36; 3. Хазипов Н . З . Репродукция вируса лейкоза крупного рогатого скота и иммунный ответ на неё / Н . З . Хазипов , Р . П . Тюрикова // Ученые записки КГАВМ .- Казань .-2008.- Т .192.- с .152-160.

ВЛИЯНИЕ ТЕРМООБРАБОТКИ МОЛОКА НА ВЫЯВЛЯЕМОСТЬ ПРОВИРУСНОЙ ДНК ВЛКРС В ПЦР

Алимов А . М ., Якупов Т . Р ., Гибадуллина И . Р ., Шаева А . Ю .

Резюме

Показано влияние термической обработки на выявляемость провирусной ДНК ВЛКРС в молоке методом полимеразной цепной реакцией . Установлено , что провирусная ДНК в молоке сохраняется после пастеризации и кипячения до 5 минут .

INFLUENCE OF HEAT TREATMENT ON DETECTION BLV PROVIRAL DNA IN MILK PCR

Alimov A.M., Yakupov T.R., Gibadullina I.R., Shaiva A.J.