Влияние условий подготовки ооцитов и донорских клеток на эффективность соматического клонирования у домашней овцы (Ovis aries L.)

Технология получения эмбрионов методом клонирования ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) может быть применена в овцеводстве для решения задач по размножению и сохранению ценных животных, а также созданию новых генотипов методами геномного редактирования. Вместе с тем эффективность SCNT у Ovis aries остается сравнительно низкой и существует необходимость в оптимизации ее отдельных этапов. В представленной работе была поставлена цель оценить результативность технологии SCNT в зависимости от применяемой среды in vitro созревания (in vitro maturation, IVM) ооцитов, их возраста на момент начала процедуры энуклеации и переноса соматической клетки (СК) в перивителлиновое пространство полученных цитопластов (nuclear transfer, NT), а также условий подготовки СК - продолжительности их сывороточного голодания (СГ) в культуре и длительности хранения в суспензии накануне NT. Изучали воздействие перечисленных факторов на образование цитогибридов в процессе слияния энуклеированного ооцита и СК (доля слияния), а также на развитие клонированных эмбрионов (доля дробления цитогибридов). Выделенные post mortem ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) созревали в ТС-199 или в среде BO-IVM от «IVF Bioscience» (Великобритания). Для NT использовали ооциты с первым полярным тельцем (ППТ) в возрасте от 20 до 23 ч (с момента начала IVM), а также фетальные фибробласты (ФФБ) в качестве донорских СК. Последние накануне культивировали до 80-100 % монослоя с последующей инкубацией в условиях СГ (для синхронизации клеточного цикла) в течение 24 или 48 ч. К процедуре переноса в энуклеированный ооцит готовили суспензию ФФБ, которую хранили до NT на протяжении различных периодов времени (£ 30, 31-90, 91-150 и > 151 мин). Полученные в результате NT-реконструирования клеточные комплексы подергали процедуре электрослияния, образовавшиеся цитогибриды активировали, после чего культивировали в течение 2 сут для эмбрионального развития. Доля слияния значимо не различалась между экспериментальными группами и варьировалась от 31 до 42 %. Также не различалась доля дробления цитогибридов, если созревание ооцитов происходило в среде ТС-199 или BO-IVM (соответственно 47,1±2,40 % и 50,9±3,30 %). Когда для процедуры NT использовали ооциты с ППТ в возрасте 22 ч, выход клонированных эмбрионов составил 55,8±3,78 %. Для более ранних ооцитов результат был сопоставимым, а более возрастные (23 ч) показали его существенное ухудшение (до 39,3±6,69 %, p function show_abstract() { $('#abstract1').hide(); $('#abstract2').show(); $('#abstract_expand').hide(); }