Влияние внеклеточных везикул, происходящих из овариальных фолликулов различного размера, на созревание ооцитов и их развитие in vitro до стадии бластоцисты у коров (Bos taurus taurus)

Производство эмбрионов в условиях in vitro (IVP) — биотехнологический подход в современном скотоводстве, позволяющий воспроизводить большее количество потомства от высокоценных животных (1, 2). Статистические данные последних лет (3-5) показывают рост коммерческой привлекательности этого подхода и повышение мирового производства IVP-

^* Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект ¹ 24-16-00261).

эмбрионов с 992 тыс. в 2017 году до 1876 тыс. в 2023 году. Одновременно возросший спрос на эмбрионы высокого качества определяет актуальность исследований, направленных на дальнейшее совершенствование отдельных этапов IVP (3). В частности, внимание уделяется поиску факторов, улучшающих качество созревающих in vitro ооцитов и повышающих их способность развиваться вне организма (6).

У млекопитающих естественной средой созревания ооцитов служит жидкость антральных фолликулов. Она содержит различные молекулы, которые опосредуют аутокринные и паракринные связи между фолликулярными клетками и созревающим ооцитом, играя решающую роль в оогенезе (7, 8). В этих коммуникациях участвуют внеклеточные везикулы (extracellular vesicles, EVs), включающие экзосомы и микропузырьки, которые секретируются клетками фолликула и способны влиять на клеточный ответ и биологическую активность посредством переноса разнообразных регуляторных молекул — РНК, белков и липидов (9, 10). Показано, что EVs фолликулярной жидкости (follicular fluid-derived extracellular vesicles, ffEVs) играют важную роль в регуляции функций клеток кумулюса, передаче сигналов от соматических клеток к ооциту (11) и, в конечном счете, в контроле развития ооцитов (12). Это позволяет рассматривать ffEVs в качестве перспективного компонента для оптимизации сред IVM для повышения качества ооцитов млекопитающих, включая крупный рогатый скот (КРС) (13, 14).

На сегодняшний день показано, что ffEVs в условиях in vitro могут существенно влиять на изменения транскриптома, протеома, экспрессии генов в ооцитах и окружающих их клетках кумулюса (КК) (14-17), а также на потенциал ооцитов к дальнейшему эмбриональному развитию (14, 1820). У КРС в среде in vitro созревания (in vitro maturation, IVM) ооцит-ку-мулюсных комплексов ffEVs усиливали экспансию КК (21) и их пролиферацию (22). Кроме того, обнаружен позитивный эффект ffEVs на коровьи ооциты, которые созревали в условиях воздействия стрессовых факторов, таких как тепловой шок и окислительный стресс, либо после созревания in vitro замораживались. То есть при воздействии везикул повышалась стрессо-и криоустойчивость ооцитов (15, 23, 24).

Хотя описанные выше результаты убедительно демонстрируют положительное влияние ffEVs на ооциты в системе IVM, остается неясным, сохраняется ли одинаковый эффект при использовании внеклеточных везикул, выделенных из фолликулов различного размера. Этот вопрос требует дальнейшего изучения, поскольку размер фолликула связан с его физиологическим статусом и качеством фолликулярной среды (25), что потенциально может определять состав и биологическую активность EVs (26, 27).

В настоящей работе мы впервые установили, что внеклеточные везикулы из фолликулярной жидкости (ФЖ) овариальных фолликулов малого (3-6 мм) и большого (более 6 мм) размеров равным образом положительно влияют на способность ооцитов развиваться до стадии бластоцисты после экстракорпорального оплодотворения.

Цель представленной работы заключалась в изучении влияния внеклеточных везикул из фолликулярной жидкости различного фолликулярного происхождения в среде созревания коровьих ооцитов на их способность к эмбриональному развитию в условиях in vitro.

Методика. Опыты проводили в ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2024 году. Во всех экспериментах, за исключением отдельно отмеченных случаев, использовали реагенты фирмы «Sigma-Aldrich» (США).

Яичники коров (Bos taurus taurus) неизвестной породной принадлеж- ности, отобранные post mortem на мясокомбинате, транспортировали в лабораторию на льду. После доставки их освобождали от прилегающих соединительных и жировых тканей, а затем многократно промывали в охлажденном до +4 °С физиологическом растворе (ФЗ), содержащем пенициллин (100 МЕ/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл), чтобы удалить компоненты крови и микробную контаминацию. Фолликулярную жидкость (ФЖ) собирали аспирацией из фолликулов диаметром 3-6 мм (small follicles, SF) и более 6 мм (large follicles, LF) и центрифугировали (центрифуга 5424 R, «Eppendorf AG», Германия) при 300 g в течение 15 мин.

На следующем этапе для освобождения от апоптотических телец и крупных микровезикул размером 200-1000 нм ФЖ центрифугировали (центрифуга 5424 R, «Eppendorf AG», Германия) по 15 мин сначала при 2000 g, а затем при 12000 g. После каждого этапа очищения полученный супернатант собирали и переносили в новые пробирки. EVs выделяли из очищенной ФЖ ультрацентрифугированием (центрифуга CS 150 NX, «Hitachi», Япония) в течение 90 мин при 100 000 g с последующим разведением супернатанта фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и повторным ультрацентрифугированием в том же режиме.

Осадок, полученный после ультрацентрифугирования, ресуспенди-ровали в 100 мкл ФСБ и хранили до использования при - 80 ° С, предварительно отобрав от полученной суспензии две аликвоты объемом по 5 мкл. Одну аликвоту использовали для определения количества EVs по концентрации белка: анализ проводили на приборе Qubit 4 Fluorometer с использованием набора Qubit Protein Assay Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США) и белкового стандарта Qubit с концентрацией от 0,125 до 5 мг/мл. Из второй аликвоты для установления присутствия EVs готовили цитологический препарат и проводили его ультраструктурный анализ с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ, микроскоп JEOL 1011, «Jeol, Ltd.», Япония), как описано ранее (28).

Для функционального эксперимента выделенные post mortem яичники коров доставляли с мясокомбината в лабораторию в теплом ФЗ (не ниже 28 ° С) и препарировали, как описано выше, используя физиологический раствор, предварительно подогретый до 37 ° С. Ооциты в составе ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) выделяли из яичников механическим способом — рассекали стенки видимых фолликулов лезвием, после чего промывали и проводили селекцию извлеченных ОКК, как было описано ранее (29). Незрелые ОКК с соответствующими морфологическими характеристиками созревали in vitro в среде ТС-199, содержащей бычий сывороточный альбумин (БСА, 3 мг/мл), пируват натрия (0,5 мМ), эпидермальный фактора роста (100 нг/мл), а также антибиотик гентамицин (50 мкг/мл) в течение 24 ч. В опытных группах в среде IVM дополнительно присутствовали EVs выделенные из жидкости фолликулов диаметром 3-6 мм (ffEVs-SF) и диаметром более 6 мм (ffEVs-LF). В обоих случаях везикулы использовали в физиологической концентрации: на 1 мл добавляли количество EVs, выделенное из 1 мл ФЖ. ОКК инкубировали группами по 25-30 ОКК в 4-лу-ночных планшетах (ООО «Биомедикал», Россия) в каплях среды объемом 500 мкл и в условиях инкубатора MCO-18AIC («Sanyo», Япония) при 38,5 ° С и 5 % СО 2 в атмосфере.

Во втором эксперименте по завершении периодов созревания (24 ч IVM) ооциты подвергали процедуре экстракорпорального оплодотворения с целью получения эмбрионов in vitro. Экстракорпоральное оплодотворение проводили в среде BO-IVF («IVF Bioscience», Великобритания). Бычью сперму размораживали и подвергали процедуре swim-up c использованием 352

среды Sperm-TALP (30). Полученную фракцию активных сперматозоидов вносили в среду ЭКО с предварительно перенесенными туда ОКК до конечной концентрации 1,5½10⁶ сперматозоидов/мл. Продолжительность совместной инкубации гамет составляла 15-16 ч. Затем ооциты освобождали от клеток кумулюса и налипших сперматозоидов и оценивали морфологически. Выявляли наличие у ооцитов полярных телец (ПТ) и определяли процент созревания (долю ооцитов с ПТ от общего числа ооцитов). Изолированные ооциты переносили в среду BO-IVC («IVF Bioscience», Великобритания) и инкубировали в ней для эмбрионального развития. Культивирование происходило при температуре 38,5 ° С и в присутствие 5 % СО 2 , 5 % О 2 и 90 % N 2 . Через 3 сут культивирования in vitro (IVC) подсчитывали число раздробившихся ооцитов, на 7-е сут инкубации определяли число ооцитов, развившихся до стадии бластоцисты.

Для оценки качества полученных бластоцист готовили и анализировали их цитологические препараты, используя протокол, описанный ниже. Эмбрионы промывали в ФСБ, содержащем 0,2 % БСА (ФСБ-БСА), и фиксировали 4 % раствором параформальдегида в ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания в ФСБ-БСА образцы подвергали процедуре пермеабилизации в 0,5 % растворе Triton Х-100 в течение 30 мин. Детекцию апоптотических ядер в эмбрионах проводили методом TUNEL с использованием набора In Situ Cell Death Detection Kit, fluorescein («Roche Diagnostics», Швейцария) согласно инструкции компании-производителя. Затем эмбрионы обрабатывали в течение 20 мин раствором DAPI (1 мкг/мл) для окрашивания ядер и переносили на предметное стекло с последующим заключением в среду Vectashield («Vector Laboratories», Великобритания).

Микрофотографирование и анализ препаратов выполняли под флуоресцентным микроскопом Axio Imager M2 («Carl Zeiss AG», Германия), оснащенным фильтром для TUNEL (возбуждение при X = 445-470 нм) и DAPI (возбуждение при X = 365 нм). Использовали цифровую камеру Axiocam 506 и программу Zen pro («Carl Zeiss», Германия). Определяли общее число ядер в эмбрионах и число TUNEL-позитивных ядер. Степень апоптоза оценивали по доле TUNEL-позитивных ядер от общего числа ядер в бластоцистах.

Статистическую обработку данных проводили при помощи лицензионного программного пакета SigmaStat 2.03.0 («Systat Software, Inc.», США). Число независимых опытов — 3. Результаты выражали как средние значения ( M) и стандартные ошибки средних (±SEM). Для оценки статистической значимости различий применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Тьюки. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты. Метод выделения EVs из фолликулярной жидкости коров основывался на дифференциальном ступенчатом центрифугировании и ультрацентрифугировании при 100 000 g, что позволяет эффективно получать фракцию EVs, представленных преимущественно экзосомами диаметром 30-150 нм. Первоначально эта методика была предложена для изоляции EVs из жидкости яйцевода (31), а в настоящем исследовании применена в несколько модифицированном виде (28). В результате из жидкости средних (SF) и больших (LF) фолликулов были получены фракции, обогащенные EVs и содержащие соответственно 46,8 и 39,2 мкг тотального белка/мл ФЖ. Полученные препараты были проанализированы с использованием ТЭМ, которая подтвердила присутствие EVs типа экзосом в обоих образцах, что послужило основанием для их дальнейшего применения в среде созревания ооцитов.

На рисунке 1 представлены типичные EVs, полученные из фолликулярной жидкости яичников коров. Отмечалось наличие как отдельных везикул, так и их агрегатов.

Рис. 1. Изображения внеклеточных везикул из фолликулярной жидкости малых (ffEVs-SF) (А) и больших (ffEVs-LF) (Б) антральных фолликулов коров ( Bos taurus taurus ) неизвестной породной принадлежности, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (увеличение 100 000½, микроскоп JEOL 1011, «Jeol, Ltd.», Япония) (University of Tours, 2024 год).

Через 24 ч культивирования коровьих ооцитов in vitro доля MII ооцитов в контроле, оцениваемая по наличию по крайней мере одного полярного тельца на момент окончания процедуры оплодотворения, составила 81,6±0,84 % (рис. 2, А). Присутствие везикул как из малых (ffEVs-SF), так и больших фолликулов (ffEVs-LF) не изменяло значение показателя, что свидетельствует об отсутствии их влияния на этот процесс.

Рис. 2. Доля ядерного созревания ооцитов (А) , их дробления (Б) и развития до стадии бластоцисты (В) после in vitro созревания в контроле и под влиянием ffEVs из фолликулярной жидкости фолликулов диаметром от 3 до 6 мм (ffEVs-SF) и более 6 мм (ffEVs-LF) и последующего экстракорпорального оплодотворения ( n = 3, M ±SEM; лаборатория эмбриональных технологий ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2024 год) .

* и ** Различия статистически значимы по сравнению с контролем соответственно при р < 0,01 и р < 0,001.

Для оценки компетенции зрелых ооцитов к эмбриональному развитию их подвергали экстракорпоральному оплодотворению. Доля дробления ооцитов в контроле составила 77,0±2,2 % (см. рис. 2, Б). Введение ffEVs в среду in vitro созревания существенно не меняло это значение: для ffEVs-SF и ffEVs-LF показатель составил соответственно 81,3±2,0 и 83,3±2,3 %. Тем не менее обнаружено влияние ffEVs как из LF, так и SF в период IVM коровьих ооцитов на их дальнейшее развитие до стадии бластоцисты (см.

рис. 2, В, рис. 3, а-в). В случае созревания ОКК в контрольной среде выход бластоцист составил 24,0±3,0 %. Введение ffEVs-SF и ffEVs-LF в среду IVM в физиологической концентрации повышало показатель до 37,4±0,7 (p < 0,01) и 41,7±1,0 % (p < 0,001).

Контроль                       ffEVs-SF                       ffEVs-LF

Рис. 3. Микрофотографии эмбрионов коров ( Bos taurus taurus ) неизвестной породной принадлежности, полученных вследствие экстракорпорального оплодотворения ооцитов, созревших в контроле и при воздействии внеклеточных везикул из жидкости овариальных фолликулов малого (ffEVs-SF) и большого (ffEVs-LF) размеров: а-в — эмбрионы, развившиеся до стадии бластоцисты (увеличение 100½, микроскоп Eclipse Ti-U, «Nikon», Япония); г-е — окрашивание ядер в бластоцисте с помощью DAPI (синий цвет; цитологический препарат), ж-и — окрашивание апоптотических ядер в бластоцисте методом TUNEL (зеленый цвет; цитологический препарат) (увеличение 400½, микроскоп Axio Imager M2, «Carl Zeiss», Германия).

Оценка качества бластоцист, полученных вследствие экстракорпорального оплодотворения коровьих ооцитов, созревших в контроле и при воздействии внеклеточных везикул из жидкости овариальных фолликулов малого (ffEVs-SF) и большого (ffEVs-LF) размеров ( n = 3; лаборатория эмбриональных технологий ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2024 год)

Группа	Общее число бластоцист, шт.	Число ядер в бластоцисте, M ±SEM
		всего, шт.	с признаками апоптоза, %
Контроль	16	79,5±1,4	6,6±0,3
ffEVs-SF	28	84,5±0,8*	4,4±0,2**
ffEVs-LF	31	87,7±1,1**	3,8±0,1**

* и ** Различия статистически значимы по сравнению с контролем соответственно при р < 0,01 и р < 0,001.

Охарактеризовано качество эмбрионов (табл.), полученных из ооцитов, созревших при воздействии ffEVs из фолликулов различного диаметра по общему числу ядер (см. рис. 3, г-е) и числу ядер с признаками апоптоза (см. рис. 3, ж-и). Цитологический анализ показал, что в контрольной группе в бластоцистах в целом число ядер соответствовало стадии развития. Добавка ffEVs-SF приводила к увеличению этого показателя (p < 0,01), равно как и добавка ffEVs-LF (p < 0,001). Также присутствие ffEVs в среде IVM ооцитов снижало долю ядер в бластоцистах с признаками апоптоза (p < 0,001). При этом значимых различий внутри опытных групп по обоим показателям обнаружено не было.

Несмотря на то, что ffEVs принимают участие в регуляции гамето-и эмбриогенеза у разных видов млекопитающих (11, 12), работ, посвященных их применению для оптимизации условий развития ооцитов и эмбрионов in vitro, немного. У животных, включая КРС особого внимания заслуживают присутствующие в фолликулярной жидкости малые внеклеточные везикулы — экзосомы, которые в основном секретируются клетками гранулезы, теки и кумулюса (32). В ряде исследований по использованию этих везикул в системе культивирования ооцитов было продемонстрировано их участие в регуляции экспрессии критически важных для качества яйцеклеток генов (17), а также выявлено положительное влияние ffEVs на способность яйцеклеток к последующему эмбриональному развитию (15).

В настоящем исследовании ffEVs добавляли в среду IVM, чтобы повысить полноценность яйцеклеток и, как следствие, эффективность получения IVP эмбрионов у КРС. При этом вносимые внеклеточные везикулы выделяли из фолликулярной жидкости овариальных фолликулов разного размера. Мы впервые обнаружили, что присутствие ffEVs не только из малых (диаметр 3-6 мм), как это было продемонстрировано ранее (13, 33, 34), но и из больших (диаметр более 6 мм) овариальных фолликулов положительно влияет на способность ооцитов развиваться до стадии бластоцисты после экстракорпорального оплодотворения (см. рис. 2, В), а также повышает качество полученных Бл (см. табл.). Эти результаты свидетельствуют о положительном влиянии обоих видов ffEVs в условиях in vitro на цитоплазматическое созревание ооцитов коров, несмотря на то, что от размера фолликула может зависеть состав и биологическая активность ffEVs (26, 27).

Таким образом, воздействие внеклеточных везикул из фолликулярной жидкости яичников (ffEVs) на коровьи ооциты во время их созревания in vitro способствует повышению компетенции к эмбриональному развитию in vitro после экстракорпорального оплодотворения. Это проявляется в повышении выхода бластоцист на 7-е сут культивирования оплодотворенных ооцитов, увеличении общего числа ядер в бластоцистах и снижении доли ядер с признаками апоптоза. Эффект наблюдается как при использовании ffEVs из овариальных фолликулов малого (диаметр 3-6 мм), так и большого (диаметр более 6 мм) размеров. Следовательно, внеклеточные везикулы, выделенные из жидкости таких фолликулов, могут быть использованы для оптимизации условий культивирования ооцитов крупного рогатого скота, созревающих in vitro.

ФГБНУ Федеральный исследовательский центр животноводства — БИЖ им. академика Л.К. Эрнста, 142132 Россия, Московская обл., г.о. Подольск, пос. Дубровицы, 60,