Влияние внеклеточных везикул, происходящих из овариальных фолликулов различного размера, на созревание ооцитов и их развитие in vitro до стадии бластоцисты у коров (Bos taurus taurus)
Автор: Сингина Г.Н., Шедова Е.Н., Узбеков Р.Э., Узбекова С.В.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Репродуктивные технологии
Статья в выпуске: 2 т.61, 2026 года.
Бесплатный доступ
Внеклеточные везикулы, выделенные из фолликулярной жидкости (follicular fluid-derived extracellular vesicles, ffEVs) яичников, вовлечены in vivo в регуляцию оогенеза, что делает их перспективным объектом для оптимизации протоколов созревания ооцитов in vitro (in vitro maturation, IVM) и, как следствие, повышения эффективности получения эмбрионов in vitro (IVP). В настоящей работе мы впервые установили, что внеклеточные везикулы (extracellular vesicles, EVs) из фолликулярной жидкости (ФЖ) овариальных фолликулов малого (3-6 мм) и большого (более 6 мм) размеров равным образом положительно влияют на способность ооцитов развиваться до стадии бластоцисты после экстракорпорального оплодотворения. Цель представленной работы заключалась в изучении влияния внеклеточных везикул из фолликулярной жидкости различного фолликулярного происхождения в среде созревания коровьих ооцитов на их способность к эмбриональному развитию в условиях in vitro. Опыты проводили в ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2024 году. ФЖ собирали аспирацией из коровьих фолликулов диаметром 3-6 мм (Small Follicles, SF) и более 6 мм (Large Follicles, LF) и последовательно центрифугировали при 300, 2000 и 12000 g в течение 15 мин, чтобы освободить ее соответственно от клеточного дебриса, апоптотических телец и крупных микровезикул. EVs из очищенной ФЖ выделяли посредством ультрацентрифугирования при 100 000 g. В результате из жидкости SF и LF были получены фракции, обогащенные EVs и содержащие соответственно 46,8 и 39,2 мкг тотального белка/мл ФЖ. Образцы проанализировали с использованием трансмиссионной электронной микроскопии, которая подтвердила, что в выделенных препаратах присутствуют EVs, соответствующие по размерам экзосомам. Ооциты коров созревали in vitro в контрольной среде (ТС-199, содержащей бычий сывороточный альбумин — 3 мг/мл, пируват натрия — 0,5 мМ и эпидермальный фактор роста — 100 нг/мл) или в среде IVM, дополненной ffEVs из ФЖ малых (ffEVs-SF) и больших (ffEVs-LF) фолликулов. Везикулярный белок добавляли в среду IVM в физиологической концентрации (на 1 мл среды количество EVs, выделенное из 1 мл ФЖ). Через 24 ч созревания ооциты подвергали экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО) и культивированию для эмбрионального развития. На 3-и сут после оплодотворения изучали морфологию раздробившихся оплодотворенных ооцитов, на 7-е сут культивирования определяли число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты (Бл). В полученных Бл определяли общее число ядер и долю ядер с признаками апоптоза (цитологический анализ). Доля созревших ооцитов была сходной в экспериментальных группах и варьировала от 81 до 84 %. Присутствие ffEVs в среде IVM не изменяло долю раздробившихся ооцитов после оплодотворения in vitro, которая составила 77,0±2,3, 81,3±2,0 и 83,3±2,5 % соответственно для контроля, ffEVs-SF и ffEVs-LF. Тем не менее было выявлено положительное влияние ffEVs как из малых, так и больших фолликулов на развитие созревших ооцитов до стадии Бл. При культивировании ооцитов в контрольной среде выход Бл составлял 24,0±3,0 %. Введение ffEVs-SF и ffEVs-LF в среду IVM повышало этот показатель соответственно до 37,4±0,7 (p < 0,01) и 41,7±1,0 % (p < 0,001). Было обнаружено положительное влияние везикул обоих видов на качество полученных Бл. В сравнении с контролем в группах ffEVs-SF (p < 0,01) и ffEVs-LF (p < 0,001) наблюдалось увеличение общего числа ядер в Бл, а также снижение доли ядер в Бл с признаками апоптоза (p < 0,001). Таким образом, использование ffEVs из ФЖ как малых, так и больших овариальных фолликулов в процедуре IVM повышает компетенцию коровьих ооцитов к развитию до стадии Бл после ЭКО, а также улучшает качество полученных бластоцист. Следовательно, ffEVs могут быть использованы для повышения эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.
Внеклеточные везикулы фолликулярного происхождения, in vitro созревание, эмбриональное развитие, апоптоз, крупный рогатый скот
Короткий адрес: https://sciup.org/142247693
IDR: 142247693 | УДК: 636.2:591.39 | DOI: 10.15389/agrobiology.2026.2.350rus
Effect of extracellular vesicles from ovarian follicles of various sizes on bovine oocyte maturation and in vitro devel-opment to blastocyst stage
Follicular fluid-derived extracellular vesicles (ffEVs) are involved in vivo in the regulation of oogenesis, making them a promising tool for optimizing in vitro oocyte maturation (IVM) protocols and, consequently, for increasing the efficiency of in vitro embryo production (IVP). In the present study, we demonstrate for the first time that extracellular vesicles (EVs) derived from the follicular fluid (FF) of small (3-6 mm) and large (> 6 mm) ovarian follicles have similarly positive effects on the ability of oocytes to develop to the blastocyst stage after in vitro fertilization (IVF). The aim of this work was to investigate the effect of ffEVs of different follicular origin, when added to the maturation medium of bovine oocytes, on their competence to in vitro embryo development. The experiments were performed at the Laboratory of Embryo Technologies of the Ernst Federal Research Center for Animal Husbandry. FF was collected by aspiration from bovine follicles measuring 3-6 mm (small follicles, SF) and more than 6 mm (large follicles, LF), and sequentially centrifuged at 300 g, 2,000 g, and 12,000 g for 15 min to remove cellular debris, apoptotic bodies and large microvesicles, respectively. Small EVs from the clarified FF were isolated by ultracentrifugation at 100,000 g. As a result, ffEV-enriched fractions were obtained from SF and LF, containing 46.8 μg and 39.2 μg of total protein per ml of FF, respectively. The samples were analyzed using transmission electron microscopy, which confirmed that obtained preparations contain ffEVs, corresponding by size to exosomes. Bovine oocytes were matured in vitro either in control medium (TC-199 containing 3 mg/mL of bovine serum albumin, 0.5 mM sodium pyruvate and 100 ng/mL of epidermal growth factor) or in IVM medium supplemented with ffEVs from small (ffEVs-SF) or large (ffEVs-LF) follicles. EV-enriched preparations were added to IVM at a physiological concentration (a preparation of ffEVs isolated from 1 ml of FF to 1mL of culture medium). After 24 h of IVM, the oocytes were subjected to IVF and subsequent in vitro embryo development. On day 3 after the IVF, the morphology of cleaved fertilized oocytes was assessed; and on day 7 of culture, the number of embryos that had developed to the blastocyst stage was determined. In the obtained blastocysts, the total number of nuclei and the proportion of nuclei showing signs of apoptosis were assessed by cytological analysis. The rates of oocyte maturation were similar among the experimental groups, ranging from 81 % to 84 %. The presence of ffEVs in the IVM medium did not alter the cleavage rate after IVF, which were 77.0±2.3 %, 81.3±2.0 %, and 83.3±2.5 % in control, ffEVs-SF and ffEVs-LF groups, respectively. Nevertheless, a positive effect of ffEVs derived from FF of both small and large follicles was observed on the proportions of mature oocytes developing to blastocyst stage. In the control IVM medium, the blastocyst rate was 24.0±3.0%. Supplementation of IVM medium with ffEVs-SF and ffEVs-LF increased blastocyst rates to 37.4±0.7% (p < 0.01) and 41.7±1.0 % (p < 0.001), respectively. A positive effect of both types of ffEVs on blastocyst quality was observed. Compared with the control group, the ffEVs‑SF (p < 0.01) and ffEVs-LF (p < 0.001) groups showed an increased number of nuclei per blastocyst and a decreased proportion of nuclei exhibiting signs of apoptosis (p < 0.001). Thus, the use of ffEVs from small and large ovarian follicles in the IVM procedure increased the competence of bovine oocytes to develop to blastocyst stage after IVF and improved blastocyst quality. Therefore, ffEVs preparations may be used to improve the efficiency of in vitro embryo production in cattle.
