Влияние замораживания на протеолитическую активность бактериального концентрата

Введение. Основным этапом в производстве бактериальных заквасок является консервирование. Замораживание является распространенным способом длительного сохранения жизнеспособности микробиологических препаратов. Воздействие низких температур может привести к повреждению плазматической мембраны, клеточной оболочки, денатурации белков, изменению ДНК микроорганизмов из-за внутри- и внеклеточного образования льда. Это ведет к денатурации белков и нарушению барьеров проницаемости [1]. На устойчивость микроорганизмов к замораживанию влияют условия и стадия развития, температура и скорость замораживания, среда замораживания. Повышают выживаемость клеток внесением различных защитных сред для замедления процессов внутриклеточного льдообразования [2–6].

Для сохранения высокой жизнеспособности микроорганизмов используют различные питательные среды: желатин, глицерин, обезжирен- ное молоко, пептон, сахарозу, сорбит, поливи-нилпирролидон, глутамат натрия и их комбинации [7].

Цель исследования – изучение протеолитической активности замороженного бактериального концентрата (ЗБК) курунговой закваски.

Задачи: определение температуры и продолжительности замораживания бактериального концентрата; изучение влияниz криопротекторов на протеолитическую активность размороженного бактериального концентрата; анализ аминокислотного состава курунги, полученной сквашиванием молока размороженным бактериальным концентратом.

Материалы и методы. Для исследования использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы биохимического, физикохимического и микробиологического анализа.

Для оценки протеолитической активности бактериального концентрата 1 мл исследуемого продукта вносили пипеткой в чашки Петри и за- ливали 10–15 мл расплавленного и охлажденного до 40–45 °С молочного агара. Посевной материал тщательно перемешивали с молочным агаром. Пробы термостатировали при температуре 30 °С в течение 48 ч. Гидролиз казеина обнаруживали по зоне просветления среды вокруг колонии [8].

Аминокислотный анализ образцов проводился методом ионной хроматографии с постколоночной дериватизацией аминокислот нингидрином в кислотном гидролизате образца на аминокислотном анализаторе INGOSААА-400.

Оценку биологической ценности проводили по методике И.А. Рогова и Н.Н. Липатова по ко- эффициентам различий аминокислотного скора (КРАС) и биологической ценности (БЦ).

Результаты и их обсуждение. На этапе замораживания формируются кристаллы льда и определяется микроструктура бактериального концентрата. При разработке технологии замороженного бактериального концентрата необходимо определить криоскопическую температуру – температуру начала кристаллизации содержащейся в ней влаги. Динамика изменения температуры при замораживании бактериального концентрата представлена на таблице 1.

Таблица 1

Показатель	Значение
Продолжительность замораживания, мин	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90	100	110	120
Температура, °С	10	–2,8	–1,3	–1,5	–2,6	–9,5	–20	–23	–24	–25	–25	–25	–25

Динамика температуры при замораживании бактериального концентрата

Из данных таблицы 1 видно, что полученный температурный профиль замораживания бактериального концентрата можно разделить на три участка. В течение 10 мин наблюдается резкое снижение температуры с постоянной скоростью до 2,8 °С. Затем наблюдается повышение температуры и равновесное состояние в течение 30 мин. В течение этого времени происходит кристаллизация влаги, снижение температуры замедляется. Известно, что при зарождении кристаллов происходит выделение скрытой теплоты [9]. Потом температура умеренно уменьшается и через 90 мин наступает полное замораживание льда при температуре минус 25 °С.

При замораживании необходимо обеспечить защиту микроорганизмов от криоповреждений. В качестве криопротекторов использовали глицерин, сахарозу, желатин, широко применяемые для консервирования микроорганизмов и обеспечивающие их высокую выживаемость.

В таблице 2 представлены данные сравнительного анализа протеолитических свойств исследуемых образцов. В качестве контроля использовали исходный инокулят – жидкую ку-рунговую симбиотическую закваску на обезжиренном молоке.

Таблица 2

Образец	Диаметр зоны просветления вокруг колоний через 48 ч культивирования, мм
Контроль – исходный инокулят	32 + 5
Бактериальный концентрат + желатин	20 + 5
Бактериальный концентрат + глицерин	45 + 5
Бактериальный концентрат + сахароза	3 + 2

Влияние криопротекторов на протеолитическую активность бактериального концентрата при замораживании

Из представленных в таблице 2 данных следует, что бактериальный концентрат, замороженный с глицерином, проявляет большую протеолитическую активность. Вероятно, это связано с высокой концентрацией микроорганизмов в бактериальном концентрате и смешанным эндо-экстрацеллюлярным действием глицерина на клетки при замораживании.

От протеолитической активности заквасочных культур зависит аминокислотный состав готового продукта [10, 11]. В таблице 3 представлены ре- зультаты оценки аминокислотного состава молока, заквашенного бактериальным концентратом с глицерином. Для сравнения использовали образец, заквашенный исходной жидкой курунговой закваской на обезжиренном молоке.

Сквашивание молока проводили в течение 8–10 ч до достижения титруемой кислотности в образцах курунги 120 °Т. Результаты исследования аминокислотного состава образцов представлены в таблице 3.

Таблица 3

Содержание незаменимых аминокислот

Аминокислота	Количество, мг/100 г продукта
	Курунга на жидкой закваске	Курунга на ЗБК
Валин	126	129
Лейцин	218	227
Изолейцин	148	140
Фенилаланин + тирозин	179	168
Метионин + цистин	87	84
Лизин	218	216
Триптофан	22	22
Треонин	112	115
Общее количество незаменимых аминокислот	1110	1101

Из данных таблицы 3 видно, что количественное соотношение незаменимых аминокислот в курунге, заквашенной ЗБК и жидкой курунго-вой закваской, практически не отличается.

Результаты расчета аминокислотного скора исследуемых образцов представлены в таблице 4.

Таблица 4

Аминокислота	Рекомендуемое кол-во по ФАО/ВОЗ, мг/г белка	Значение аминокислотного скора, %
		Курунга на жидкой закваске	Курунга на ЗБК
Валин	39	115	117
Лейцин	59	132	137
Изолейцин	30	176	166
Фенилаланин + тирозин	38	168	157
Метионин + цистин	22	140	136
Лизин	45	173	171
Триптофан	6	133	133
Треонин	23	173	178

Аминокислотный скор белков кисломолочных продуктов

Из таблицы 4 видно, что белки исследуемых кисломолочных продуктов характеризуются полноценным аминокислотным составом. По всем незаменимым аминокислотам во всех образцах наблюдается избыток относительно физиологических потребностей организма человека.

Коэффициент различия аминокислотного скора (КРАС) и биологическая ценность белка (БЦ) указывают предельно возможный уровень использования азота белка на пластические цели (табл. 5).

Таблица 5

Показатель	Курунга на жидкой закваске	Курунга на БКМК
КРАС	36,5	35,37
БЦ	63,5	64,6

Показатели сбалансированности аминокислотного состава кисломолочных продуктов, %

Из таблицы 5 видно, что сбалансированность состава незаменимых аминокислот в обоих образцах курунги имеет почти одинаковые значения. Полученные данные свидетельствуют о соответствии биохимической активности бактериального концентрата микробного консорциума естественной курунговой закваске и возможности получения продукта с биологически ценным составом белка, характерным для традиционного напитка.

Заключение. В результате проведенного исследования установлено, что замораживание бактериального концентрата в течение 90 мин до температуры минус 25 °С с глицерином позволяет сохранить высокую протеолитическую активность закваски и производить курунгу с высокой биологической активностью.