Влияние «Защищенных» аминокислот на количество оксида азота (II), половых гормонов и биохимических показателей в организме коров на разных стадиях полового цикла

Снижение уровня воспроизводства или яловость, являются следствием множества причин. На репродуктивные функции коров существенно влияют некорректное управление стадом, проблемы с обменом веществ, внешние факторы. Наряду с этим, воспроизводительные качества коров определяет кормление, в частности, наличие некоторых аминокислот. Наиболее значимы в питании метионин и лизин. Это ключевые регуляторы обменных процессов, выполняющие множество важных функций в организме животных. Соответственно, вместе с аргинином, они наиболее изучены с точки зрения воздействия на воспроизводство. Введение в рационы жвачных защищённых от распада в рубце метионина и лизина способно улучшить показатели воспроизводства как, повышая эффективность использования азота корма, так и в качестве биологически активных веществ, стабилизирующих течение беременности и улучшающих качество потомства [1, 5, 8, 9].

Недостаток лизина в зерновых продуктах, при сравнительно высокой потребности организма в нем, ставит проблему его содержания в кормах на одно из первых мест. Он необходим для роста, восстановления тканей, производства антител, гормонов и ферментов. Его дефицит в рационе молодых крыс, прекращает рост последних с одновременным развитием гипопротеин анемии; отмечается нарушение гемопоэза и, как результат, уменьшается число эритроцитов, количество гемоглобина. Лизин участвует в утилизации жирных кислот, необходимых для производства энергии; помогает устранять проблемы, связанные с бесплодием; катализирует процессы ферментативных превращений; способствует абсорбции кальция, поддержанию баланса азота во взрослом организме, образованию коллагена и восстановлению тканей; снижает повышенный уровень триглицеридов в сыворотке крови; усиливает иммунитет к вирусным инфекциям [4, 7, 10].

Метионин необходим для синтеза белков, поддержания роста и азотистого равновесия организма. Для нормального функционирования его систем, важно употребление в пищу продуктов богатых витаминами В12, В6 и фолиевой кислоты, способствующих превращению гомоцистеина в метионин и цистеин. При недостатке последних наблюдается переизбыток токсичного для организма гомоцистеина (гомоцистеинемия). Метионин также необходим для выведения жиров из печени и их окисления; он является предшественником таурина и глутатиона – основных антиоксидантов в организме животного, которые помимо защиты от окислительного повреждения, выполняют ряд других значимых функций. Так, таурин регулирует постоянство внутренней среды клетки, ключевой компонент в передаче нервных импульсов и составляющая желчи, т.е. обязателен для нормального усвоения жиров и жирорастворимых витаминов. Это соединение оказывает положительный эффект на сердечно-сосудистую, пищеварительную, эндокринную, иммунную, нервную и репродуктивную системы [1, 5, 6, 13].

Известно использование лизина и метионина в медицине как регуляторов продукции оксида азота (II), способного воздействовать в равной мере на физиологические процессы как внутриклеточного, так и межклеточного генеза. Их нарушение ведет к различным заболеваниям, таким как артериальная гипертензия (в т.ч. гипертоническая болезнь), ишемическая болезнь сердца, тромбозы, онкология. Оксид азота (II) – потенциально токсическое соединение, которое широко используется организмом в разнообразных патологических процессах. Его действие на клетку может быть токсичным для клеток, включая опухолевые клетки внутриклеточные патогенные микроорганизмы [2, 3].

Обнаружено множество способов регуляции продукции этого соединения клетками, органами и тканями, как физиологически, под контролем собственно организма, так и внешними корректорами, а именно, медикаментозными и немедикаментозными, воздействиями. Эффект оксида азота (II) опосредован его концентрацией. Малые (физиологические) концентрации сопровождают функционирование конститутивных эндотелиальных и нейронных изоформ, оказывают цито- и нейропротекторное действие; обладают выраженной антиапоптотической активностью, вероятно, за счет непосредственного нитрозилирования внутриклеточных цистеиновых протеаз (каспаз -3, -8) и других проапоптотических белков. В больших концентрациях оксид азота (II) индуцирует апоптоз клеток определенного типа – макрофагов, тимоцитов, клеток островков поджелудочной железы, некоторых нейронов и опухолевых клеток [2, 10, 12].

Большое влияние на систему оксида азота оказал новый препарат L-лизина –

«Лизиний». L-лизин блокирует постсинаптическую мембрану глутаматергического синапса, уменьшая тем самым продукцию свободных метаболитов оксида азота (II). Производное 1,2,4-триазол-5-тиоацетата в составе препарата способно образовывать нитротиольные комплексы с дериватами оксида азота (II). Гипергомоцистеинемия у крыс сопряжена со снижением концентрации метаболитов NO в митохондриях клеток сердца, а изменения в этих органеллах после введения метионина имеют некоторое сходство с таковыми после введения L-NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME). Можно утверждать, что дефицит оксида азота играет важную роль в патогенезе дисфункции митохондрий кардиомиоцитов при гипергомоцистеинемии [5, 10].

Цель настоящего исследования состояла в изучении влияния защищенных от распада в рубце лизина и метионина на содержание оксида азота, а также на показатели воспроизводства и репродуктивного здоровья коров.

Для достижения этой цели решались следующие задачи: определить влияние в основном рационе коров «защищенных» аминокислот на уровень содержания в сыворотке крови оксида азота (II) в различных стадиях полового цикла; определить влияние в основном рационе коров «защищенных» аминокислот на уровень содержания в сыворотке крови половых гормонов в различных стадиях полового цикла; определить влияние в основном рационе коров «защищенных» аминокислот на уровень содержания в сыворотке крови биохимических показателей в различных стадиях полового цикла.

Материал и методы исследований. Исследования выполнены на 60 коровах черно-пестрой породы, в возрасте 4-8 лет в КФХ «Хадиев Д.М.» Кукморского района Республики Татарстан в 2020 году. Животные содержались в типовых помещениях на привязи, с моционом в загоне.

Животных распределили в две группы по 30 голов в каждой: 1 – контрольная; 2 – опытная. Продолжительность учетного периода опыта составила 90 суток.

Все животные получали с 11 по 100 сутки лактации одинаковый основной рацион. Кроме того, коровы 2 опытной группы получали к основному рациону 60 г/сутки на голову, «защищенного» лизина (ЛизиперлТМ компании «Kemin» Россия), содержащего около 50 % лизина в виде L-лизин моногидрохлорид, и 20 г/сутки на голову, «защищенного» метионина (Мепрон Mepron® Россия) с содержанием 85 % чистого DL-метионина. В 1 кг испытуемой кормовой добавки ЛизиперлТМ содержится: 99,5 % сухого вещества, 475 г сырого протеина, 46 % расщепляемого протеина, 198 г усвояемого лизина и 28 МДж обменной энергии. В 1 кг испытуемой кормовой добавки Мепрон (Mepron®) содержится сырого протеина 50,0 %, сырой клетчатки 3 %, сырого жира 1 %, сырой золы 1,5 %, чистой энергии 5,2 МДж/кг (1,25 Мкал/кг). Суточную дозу «защищенных» аминокислот скармливали в два приёма – утром и вечером во время раздачи комбикормов.

В течение опыта была подобрана группа коров в охоте (10 голов). Стадию их полового цикла устанавливали при помощи трансректального ультразвукового сканирования, позволяющего с высокой степенью достоверности определить половые состояния, особенности эмбрио- и фетогенеза, устанавливать морфологические характеристики органов половой системы.

Суммарную концентрацию нитрат-и нитрит-анионов в сыворотке крови определяли путем восстановления нитратов в нитриты цинковой пылью ООО «Арсенал», (Украина). Для этого к 1 мл сыворотке добавили 1 мл 6 % раствора цинка сульфата ООО «Спектр-Хим», (Россия) и оставляли на 1 час при температуре ниже 15 °С. Центрифугировали при 6000 об./мин (3000 g). В супернатант добавляли эквивалентное количество гидроксида натрия (300 мкл 1 № раствора), центрифугировали и 1 мл надосадочной жидкости переносили в соответствующую по нумерации пластиковую пробирку с предварительно добавленными туда 0,11 г цинковой пыли, 0,5 мл аммиачного буфера, 20 мкл аммиачного комплекса сульфата меди. Пробирки укупоривали и встряхивали в течение 30 мин. Цинковую пыль осаждали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 мин. Затем в каждую пробирку вносили по 1 мл раствора ацетата натрия и 1 мл раствора 1-нафтиламина солянокислого ООО «Вектон» (Россия). Измеряли оптическую плотность спустя 30 мин на «Фотометре фотоэлектрическом КФК–3–0 –ЗОМЗ ОАО «ЗОМЗ»» (Россия) при длине волны 520 нм.

В сыворотке крови определяли содержание прогестерона, эстрогена и биохимических показателей спектрометрическим методом на биохимическом анализаторе «Би-Ан» АБхФк-02–«НПП-ТМ» ЗАО НПП «Техномедика" (Россия) с набором реактивов ООО «Ольвекс диагностикум» (Россия).

Концентрацию общего белка в сыворотке крови определяли при помощи биуретовой реакции с набором реактивов «Ольвекс» (Россия), с последующим измерением оптической плотности на биохимическом анализаторе «Би-Ан» (Россия) при длине волны 540 нм.

Концентрацию мочевины в сыворотке крови определяли ферментативным кинетическим методом с набором реактивов «Ольвекс», (Россия). Мочевина гидролизуется в присутствии уреазы с образованием иона аммония и CO 2 . Ионы аммония реагируют с α–кетоглутаратом и НАДН в присутствии глутаматдегидрогеназы (ГЛДГ) с образованием глутамата и НАД. Оптическую плотность проб и стандарта измеряли через 30 секунд и через 60 секунд на биохимическом анализаторе «Би-Ан» (Россия) при длине волны 340 нм.

Концентрацию креатинина в сыворотке крови определяли кинетическим методом с набором реактивов «Ольвекс» (Россия). В щелочной среде креатинин взаимодействует с пикриновой кислотой с образованием окрашенного в красный цвет продукта, оптическую плотность которого измеряли после 30 секунд и 90 секунд на биохимическом анализаторе «Би-Ан» (Россия) при длине волны 510 нм. По разности оптической плотности рассчитывали концентрацию креатинина в пробе и в стандарте.

Концентрацию АСТ (аспартатаминотрансфераза) в сыворотке крови определяли с набором реактивов «Ольвекс» (Россия). Под действием фермента АСТ в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартата на α-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции оксалоацетат при участии фермента малатдегидрогеназы и кофермента НАДН 2 превращается в малат. Скорость окисления НАДН 2 в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и пропорциональна активности АСТ.

Концентрацию АЛТ (аланинаминотрансфераза) в сыворотке крови определяли с набором реактивов «Ольвекс» (Россия). Под действием фермента АЛТ в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции пируват при участии фермента ЛДГ и кофермента НАДН 2 превращается в лактат. Скорость окисления НАДН 2 в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и пропорциональна активности АЛТ.

Концентрацию кальция в сыворотке крови определяли унифицированным колориметрическим методом с набором реактивов «Ольвекс», (Россия). Кальций в щелочной среде образует окрашенный комплекс с о-крезолфталеин комплексоном. Интенсивность окраски по оптической плотности при 570 нм на биохимическом анализаторе «Би-Ан» (Россия) пропорциональна концентрации кальция в пробе.

Концентрацию фосфора в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом на «Анализаторе биохимическом фотометрическом кинетическом Би-Ан» (Россия) с набором реактивов «Ольвекс», (Россия). Метод основан на способности фосфат ионов образовывать в кислой среде с молибдатом аммония в присутствии детергента фосфорномолибденовый комплекс, оптическая плотность которого при длине волны 340 нм пропорциональна концентрации неорганического фосфора в исследуемом образце.

Биометрическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием критерия t-Стьюдента, достоверно значимым считали различия при уровне p<0,05. Для выявления связи между показателями использовали метод корреляционного анализа. Определяли коэффициент корреляции методом квадратов Пирсона, используя программу MS Excel, и выделяли три диапазона уровня связи: сильный – от 0,7 до 1,0; средний – от 0,3 до 0,699 и слабый – от 0 до 0,299.

Результат исследований.

Результаты исследования влияния защищенных аминокислот на содержание гормонов и оксида азота в крови коров в разные стадии полового цикла у контрольной группы представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Содержание гормонов и оксида азота в крови коров в разные стадии полового цикла у контрольной группы

Стадия полового цикла	Прогестерон, нг/мл	Эстроген, пг/мл	Оксид азота, мкмоль/л
Возбуждение	1,1±0,74	40,6±0,62	76,5±1,96
Торможение	4,2±0,79*	36,5±0,49*	73,2±1,36
Уравновешивание	5,6±0,81	33,9±1,21	71,8±0,38*

* - достоверно по сравнению со стадией уравновешивания р<0,05

В период охоты концентрация прогестерона в крови коров составила

1,1±0,724 нг/мл, а уровень эстрогена и оксида азота был максимальным 40,6 ±

0,62 пг/мл и 74,5±1,96 мкмоль/л, соответственно. В первые сутки полового цикла у всех животных выявлена овуляция фолликулов.

Продукция прогестерона значительно возрастает уже в начале стадии торможения, достигая максимального содержания 4,2±0,79 нг/мл. Резкое увеличение уровня прогестерона в крови обусловлено формированием и началом функционирования желтого тела. Одновременно у всех коров во время подъёма уровня прогестерона наблюдается спад уровня эстрогена до 38,5±0,49 пг/мл и оксида азота (II) до 71,2 ±1,36 мкмоль/л.

В стадия уравновешивания до начала овуляции уровень эстрогена и оксида азота в крови достигает минимальных значений 33,9±1,21 пг/мл и

64,8±0,88 мкмоль/л, соответственно; уровень прогестерона, в свою очередь, достигает максимума и составляет 5,6± 0,81 пг/мл.

Корреляционный анализ показал высокий уровень взаимосвязи между эстрогеном и оксидом азота (II), где величина коэффициента корреляции составляет (r=0,552; р<0,05). Также наблюдается значительная, но отрицательная, корреляция уровней прогестерона и оксида азота (II) (r = -0,521; р<0,05).

Результаты исследования влияния «защищенных» аминокислот на содержание гормонов и оксида азота в крови коров в разные стадии полового цикла у опытной группы представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Содержание гормонов и оксида азота в крови коров в разные стадии полового цикла у опытной группы.

Стадия полового цикла	Прогестерон, нг/мл	Эстроген, пг/мл	Оксида азота (II), мкмоль/л
Возбуждение	2,3±0,97	50,6±1,62*	71,2±1,66
Торможение	5,8±2,19*	40,5±2,49*	70,2±2,64
Уравновешивание	6,1±1,91*	36,3± 2,91	68,2±2,28*

* - достоверно по сравнению с контрольной группой р<0,05

Таблице 3 – Концентрация биохимических показателей в сыворотке крови коров

Показатель	Контрольная	Опытная
Общий белок, г/л	74,15±1,20	62,31±1,35*
Альбумин, г/л	27,82±1,32	30,76±1,41
Глобулин, г/л	55,69±2,29	57,39±1,15
Мочевина, ммоль/л	6,12±0,24	6,91±0,43
Креатинин, мкмоль/л	79,43±0,83	93,24±1,61*
АЛТ, МЕ/л	31,34±1,76	22,80±3,22*
Щелочная фосфатаза, МЕ/л	78,64±7,68	76,28±5,28
АСТ, МЕ/л	77,86±6,72	67,26±4,24*
Кальций, ммоль/л	2,46±0,07	2,43±0,16
Фосфор, ммоль/л	2,23±0,06	1,04±0,15
Магний, ммоль/л	1,16±0,05	1,25±0,09

* - достоверно по сравнению с контрольной группой р<0,05

Согласно данным таблицы 2, следует, что введение в рацион коровам «защищенных» аминокислот сопровождается активностью уровня эстрогена в разных стадиях полового цикла. Выявлено увеличение концентрации в стадии возбуждения – в 1,3 раза (р<0,05) в стадии торможения – в 1,2 раза (р<0,05) и в стадии уравновешивания в 1,3 раза (р˃0,05) по сравнению со значениями контрольной группы. Количество прогестерона в сыворотке крови у коров имело тенденцию к незначительному снижению в стадии возбуждения – в 1,1 раза (р˃0,05), стадии торможения – в 1,0 раза (р<0,05) и в стадии уравновешивания – в 1,1 раза (р<0,05). Динамика содержания оксида азота (II) характеризовалась значительным снижением концентрации в стадию возбуждения – в 1,1 раза (р<0,05), стадию торможения в 1,0 раз (р<0,05), стадию уравновешивания – в 1,0 (р<0,05) раз, по сравнению со значениями контрольной группы.

Результаты исследования влияния защищенных аминокислот на концентрацию биохимических показателей сыворотке крови коров представлены в таблице 3.

Все изученные биохимические показатели крови животных подопытных групп находились в пределах физиологической нормы. Для характеристики белкового обмена определяли общий белок, альбумины, глобулины и конечные продукты распада белков – мочевину и креатинин. Количество общего белка сыворотки крови у всех опытных групп снижалось на 62,31±1,35 г/л (р<0,05).

Изменение уровня мочевины в крови связано в первую очередь с функциональным состоянием печени. Повышенная концентрация этого соединения при нормальных значениях других биохимических показателей крови свидетельствует о высокой степени усвоения протеина кормов. Показатели мочевины во всех группах менялся незначительно.

Креатинин, являясь одним из компонентов остаточного азота, позволяет оценить выделительную функцию почек и интенсивность метаболизма в мышечной ткани коров. У коров опытной группы уровень креатинина увеличивается до 93,24±1,61 мкмоль/л (р<0,05).

Ферменты АСТ и АЛТ играют важную роль в обмене аминокислот. Они обнаруживаются у коров во всех органах и тканях, но повышение их уровня в крови происходит при поражениях печени, скелетной мускулатуры, миокарда. У опытной группы коров количество АСТ ниже на 14 %, АЛТ - на 10 % по сравнению с контрольной группой.

Известно, что минеральные вещества входят в состав всех органов и тканей организма и играют важную роль в процессах обмена. Они участвуют во многих физиологических процессах в роли катализаторов, в создании оптимальной среды для действия ферментов и гормонов и т. д. В опытной группе наблюдали некоторое снижение фосфора на 1,04± 0,05 мкмоль/л (р<0,05).

Заключение. Установлено, что кормление коров защищенными аминокислотами сопровождается увеличением содержания эстрогена и прогестерона, незначительным снижением оксида азота (II). Результаты исследований и их анализ показывает положительное влияние защищенных аминокислот на воспроизводительные качества коров.

Резюме

Кормление коров «защищенными» аминокислотами сопровождается увеличением содержания эстрогена и прогестерона, незначительным снижением оксида азота (II) в сыворотке крови. Стоит отметить, что у коров опытной группы улучшился репродуктивный цикл, оплодотворяемость и общее состояние.