Внеклеточная ДНК при доброкачественной гиперплазии предстательной железы у старых и молодых крыс

Extracellular DNA in benign prostatic hyperplasia in old and young rats

I.N. Vasilievа1, V.G. Bespalov1,2, A.L. Semenov1, G.V. Tochilnikov1, V.A. Romanov1, V.A. Alexandrov1

Д оброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) является заболеванием с высокой встречаемостью и непрерывным приростом более половины мужчин старше 50 испытывают симптомы ДГПЖ, и уже к 80 годам эта цифра достигает 80% [1]. Существующая ранняя диагностика неспецифична и, зачастую, субъективна, что создает потребность в дополнительных инструментальных обследованиях, накладывая существенное бремя как на самого пациента, так и на систему здравоохранения [2]. В качестве неинвазивного биомаркера ДГПЖ и рака предстательной железы (ПЖ) сегодня предлагается определять уровень внеклеточной ДНК (внДНК) в периферической крови [3,4]. При этом известно, что внДНК успешно обнаруживается в 50% образцов плазмы и более чем в 70% образцов мочи, а специфичность и чувствительность таких тестов колеблется в пределах от 80% до 99,9% [3]. В сравнении, специфичность тестов на определение простатспецифи-ческого антигена (ПСА) не превышает 70% [4].

ВнДНК представляет собой продукт гибели клеток, связанный с апоптозом, некрозом и фагоцитозом. Продолжительная циркуляция внДНК в крови может свидетельствовать о наличии в организме доброкачественных или злокачественных очагов патологий, дифференцирование которых связано с определением общего уровня и целостности внклДНК [4-6]. При раке ПЖ в частности, и злокачественных новообразованиях в целом, наблюдается преобладание некроза, что связывают с выделением в кровоток большого количества неупорядоченных фрагментов внДНК различной длины. В то же время, ДГПЖ связывают с процессами апоптоза, в которых происходит преобладание фрагментов внДНК в пределах от 180 до 210 пн. Известно, что уровень внДНК при ДГПЖ выше, чем в популяции здоровых мужчин, однако значимо ниже, чем среди мужчин с раком ПЖ [4].

Цель настоящего исследования – изучение содержания внДНК в крови у молодых и старых крыс в норме и при индукции доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 45 самцах крыс линии Вистар двух возрастных групп: в возрасте 3 и 24 месяца, весом 140-160 и 300-350 г, соответственно, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область). Содержание животных соответствовало стандартным условиям вивария барьерного типа, с температурой воздуха 22±3°С и относительной влажностью 50±10%, при контролируемом 12/12 световом режиме. Животные были размещены в полипропиленовых клетках, до пяти самцов в каждой, получая стандартный комбикорм для содержания лабораторных грызунов (ООО Лабораторкорм, Москва) и питьевую водопроводную воду ad libitum. Все манипуляции осуществлялись по разрешению этического комитета ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России и в соответствии с требованиями директивы 2010/63/EU Европейского Союза.

Индукция доброкачественной гиперплазии предстательной железы

Через 7 дней после размещения животные в обеих возрастных выборках были рандомизированы на группу интактного контроля и группу индукции ДГПЖ (всего 4 группы). На 1-ый день эксперимента осуществлялась хирургическая кастрация: орхидэктомия производилась в стерильных условиях под эфирным наркозом путем разреза по средней линии мошонки. После перевязывания семенного канатика и сосудов производилось удаление яичек с придатками. Культя семенного канатика заправлялась через ингвинальный канал в брюшную полость, после чего мошонку зашивали. Начиная с 7-х суток после орхидэктомии и далее через день животные подкожно получали тестостерон (Omnadren 250, Jelfa, Poland) в дозе 25 мг/кг массы тела, суммарно 7 инъекций, в течение 20 дней. Через 7 дней после последней инъекции (36-й день после кастрации) производился забой животных парами эфира, осуществлялись забор крови и выделение ПЖ.

Анализ предстательной железы

Всем животным произведена полная аутопсия. ПЖ изолировалась в виде комплекса дорсолатерального отдела, вентральных долей ПЖ и семенных пузырьков с передними долями ПЖ (коагуляционными железами). ПЖ очищали от других тканей, доли разделялись и взвешивались – отдельно дорсолатеральный отдел, попарно – вентральные и передние доли. Для оценки увеличения ПЖ рассчитывали простатический индекс (ПИ) как отношение веса дорсолатеральной и вентральных долей ПЖ в мг/100 г веса тела.

Гистологический и морфологический анализ тканей предстательной железы

ПЖ крыс фиксировали в 10% забуференном нейтральном формалине и далее производилась стандартная гистологическая обработка. С заключенных в парафине блоков тканей ПЖ производились срезы толщиной 5 мкм и окрашивались гематоксилин-эозином. Морфологический анализ проводили при световой микроскопии.

Уровень внеклеточной ДНК в периферической крови

Содержание внДНК в плазме крови определяли с использованием набора Cell Death Detection Elisa (Roche, Sigma-Aldrich). Определение основано на количественном сэндвич-иммуноферментном анализе. Два мышиных антитела против ДНК (одно- и двухнитевой) и гистонов (Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4) специфично связывают моно- и олигонуклеосомы, происходящие из экспериментальная и клиническая урология № 3 2 0 19 ядер эукариотических клеток (Cat. No.11 774 425 001, . Измерение абсорбции с длиной волны 450±10 нм проводили на планшете Microplane reader ChroMate (Awareness Thechnology Inc, США). Измеряли концентрацию ДНК положительного контроля набора Elisa спектрофотометрически (NanoPhotometer N-50, Implen, Германия). При разведении положительного контроля строили калибровочную кривую для определения количества внДНК в пробах.

Уровень тестостерона в периферической крови

Уровень тестостерона в сыворотке крови определялся иммуноферментно с использованием набора «DRG Testosteron ELISA» (DRG Instruments GmbH, Германия). Измерение абсорбции с длиной волны 450±10 нм проводили на планшете Microplane reader ChroMate (Awareness Thechnology Inc, США).

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего). Анализ проводился при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 7, значимость различий оценивалась по t-критерию Стьюдента. Значения p<0,05 считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования представлены в таблице 1. В группе интактных животных уровень внДНК у старых крыс был достоверно выше, чем у молодых (p<0,05). Масса тела старых крыс была в 1,6 раз больше, чем у молодых (p<0,001), в то время как масса ПЖ в 1,4 раза. Различия в величине ПИ у молодых и старых крыс не были статистически значимы. Уровень тестостерона в крови молодых крыс был в 1,6 раз выше, чем у старых (p<0,05).

Морфологическое исследование тканей ПЖ молодых крыс не выявило наличия ДГПЖ, в то время как у старых животных наблюдалась очаговая гиперплазия (рис.1).

В группе животных с ДГПЖ уровень внДНК у старых крыс аналогично был достоверно выше, чем у молодых (p<0,001). Масса тела старых крыс оказалась в 1,8 раз больше, чем у молодых (p<0,001), в то время как масса ПЖ в 2,3 раза (p<0,001). Величина ПИ у старых крыс была статистически значимо выше, чем у молодых (p<0,05). Уровень тестостерона в крови молодых и старых крыс значимо не отличался (табл. 1). Морфологический анализ молодых и старых животных подтвердил наличие ДГПЖ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нами обнаружено значимое увеличение уровня внДНК у старых крыс по сравнению с молодыми, что коррелирует с данными литературы о возрастных увеличениях уровня внДНК у человека [7]. Следует отметить, что возрастные изменения у крыс сопровождаются значимым увеличением массы тела животного. Установлено, что скорость апоптоза c возрастом повышается во многих клеточных популяциях и органах, включая центральную нервную, сердечно-сосудистую, иммунную, эндокринную и репродуктивную системы [8]. Полагают, что у пожилых людей внДНК выделяется не только в связи системной потерей клеток, но и в результате хронических воспалительных процессов [7].

Сегодня известно, что присутствие хронического воспаления, как у человека, так и у животных, представляет собой фактор риска предраковых и раковых состояний в разных органах, в том числе в ПЖ. При этом,

Таблица 1. Сводный анализ показателей в группе крыс с ДГПЖ и в группе контроля

Table 1. Summary analysis of indicators in the group of rats with BPH and in the control group

	Группа и число кры		с Group and number of rats
Показатели Indicators	1 группа Молодые интактные крысы, n=11 1 group Young intact rats	2 группа Молодые крысы с ДГПЖ, n=12 2 group Young rats with BPH	3 группа Старые интактные крысы, n=10 3 group Old intact rats	4 группа Старые крысы с ДГПЖ, n=12 4 group Old rats with BPH
Внеклеточная ДНК (ИФА), нг/мкл Extracellular DNA (ELISA), ng / μl	1,02±0,30	0,80±0,14	2,00±0,14 vs1*	3,14±0,76 vs2** vs3*
Вес тела, г Body weight g	251,0±5,5	237,0±9,2	410,0±9,8 vs1***	436,0±15,7 vs2***
Вес предстательной железы, мг Prostate weight, mg	623,0±27,4	1273,0±79,1vs1***	879,0±104,3 vs1*	2884,0±102,9 vs2***, vs3***
Простатический индекс Prostatic index	248,0±10,3	540,0±36,5 vs1***	213,0±23,1	669,0±30,4 vs2*, vs3***
Тестостерон, нмоль/л Testosterone, nmol / L	6,20±0,93	15,76±0,51 vs1***	3,77±0,55vs1*	16,99±1,10 vs3***

Достоверность отличий отмечена: vs1 – с группой 1; vs2 – с группой 1; vs3 – с группой 3; * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 Significance of differences is noted: vs1 – with group 1; vs2 – with group 1; vs3 – with group 3; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001

экспериментальная и клиническая урология № 3 2 0 1 9 развитие ДГПЖ связывают с нарушением баланса клеточной пролиферации и апоптоза [4]. Полагают, что в основе развития ДГПЖ лежит снижение апоптоза в тканях ПЖ [9]. В частности, показано, что с возрастом атрофические ацинусы в ограниченных участках эпителия ПЖ сохраняются, не подвергаясь апоптозу [9]. Однако, присутствие в тканях большого количества дефектных клеток способствует формированию про-воспалительного фенотипа, вызывая аккумуляцию иммунокомпетентных клеток в тканях ПЖ, а именно Т-лимфоцитов и макрофагов [10]. Эпителиальные и стромальные клетки ПЖ, а также воспалительные клетки индуцируют локальный иммунный ответ. При дости- жении критического уровня Т-лимфоцитов происходит разрушение клеток ПЖ CD8+цитотоксичными Т-клет-ками. Это приводит к замещению тканей ПЖ фиброзномышечными узлами и увеличению объема ПЖ. Вероятно, при этом в крови продолжительно присутствуют фрагменты внДНК замещенных железистых клеток.

Другим объяснением увеличения гибели клеток и повышения общего уровня внДНК могут являться возрастные нарушения кровообращения и локальная гипоксия, которые приводят к образованию очагов ишемии в органах малого таза [11]. В результате, ишемический некроз и сопутствующие процессы апоптоза приводят к появлению в кровотоке внДНК [12].

Вентральная доля ventral lobe

Дорсолатеральная доля dorsoloteral lobe

Передняя доля anterior lobe

Молодые крысы

Young rats

Интактные ДГПЖ

intact

BPH

Старые крысы

Old rats

Интактные           ДГПЖ intact                          BPH

НОРУ4ЛЬН1Я ТТЛИЬ      Очаг ДГПЖ normal tissue       BPH focus

Рис. 1. Гистологические особенности ДГПЖ у старых и молодых крыс.

Молодые интактные крысы: вентральная доля предстательной железы (ПЖ) – ацинусы ровные, овальной формы с тонкими стенками без складок, равномерно заполненные секретом; дорсолотеральная доля ПЖ – ацинусы ровные, произвольной формы с тонкими стенками допускается складчатость, равномерно заполненные секретом; передняя доля ПЖ – крупные ацинусы, стенки складчатые двуслойные.

Молодые крысы, ДГПЖ: вентральная доля ПЖ – изменение клеточных стенок ацинусов, появляется складчатость, выраженная гиперплазия мышечной ткани; дорсолотеральная доля ПЖ – выраженная гиперплазия стенок ацинусов и мышечной ткани; передняя доля ПЖ – стенки ацинусов с выраженной гиперплазией.

Старые интактные крысы: вентральная доля ПЖ – появляются признаки ДГПЖ в скоплении и умельчении ацинусов, обнаруживается складчатость; дорсолоте-ральная доля ПЖ – наблюдается низкое содержание секрета, складчатость стенок; передняя доля ПЖ – признаки ДГПЖ: очаговая высокая складчатость.

Старые крысы, ДГПЖ: вентральная доля ПЖ – очаговая складчатость ацинусов и гиперплазия мышечной ткани; дорсолотеральная доля ПЖ – выраженная гиперплазия мышечной ткани, утолщение стенок; передняя доля ПЖ – стенки ацинусов и мышечная ткань с выраженной гиперплазией.

• Fig. 1. Histological features of BPH in old and young rats

Young intact rats: ventral prostate lobe – acini smooth, oval in shape with thin walls without folds, uniformly filled with secretion; dorsoloteral prostate lobe – acini smooth, of arbitrary shape with thin walls, folding is allowed, evenly filled with secretion; anterior prostate lobe – large acini, folded bilayer walls.

Young rats, BPH: ventral prostate lobe – a change in the cell walls of the acini, there is folding, severe hyperplasia of muscle tissue; dorsoloteral prostate lobe – severe hyperplasia of the walls of the acini and muscle tissue; the anterior prostate lobe is the wall of the acini with severe hyperplasia.

Old intact rats: ventral prostate lobe – there are signs of BPH in the accumulation and reduction of acini, folding is detected; dorsoloteral prostate lobe – there is a low content of secretion, folding of the walls; anterior prostate lobe – signs of BPH: focal high folding.

Old rats, BPH: ventral prostate lobe – focal folding of the acini and hyperplasia of muscle tissue; dorsoloteral prostate lobe – severe hyperplasia of muscle tissue, thickening of the walls; anterior prostate lobe – the walls of the acini and muscle tissue with severe hyperplasia.

экспериментальная и клиническая урология № 3 2 0 19

В нашем эксперименте среди старых особей при развитии ДГПЖ увеличение уровня внДНК коррелировало с наибольшим увеличением веса ПЖ и ПИ, а также сопровождалось гистологическими изменениями ткани ПЖ (рис. 1). Стоит отметить, что уже у интактных старых особей наблюдались признаки очаговой гиперплазии, а у старых крыс с ДГПЖ гиперплазия значительно прогрессировала. Таким образом, накопление очагов воспаления и ремоделирование тканей ПЖ в когорте старых особей приводило к высвобождению внДНК в системный кровоток, повышение уровня которой можно наблюдать в нашем эксперименте.

С другой стороны, можно говорить и о гормональной природе развития ДГПЖ и ее связи с естественными процессами старения. В нашем исследовании, уровень тестостерона у старых интактных крыс был статистически значимо ниже такового у молодых интактных животных, однако, уровень внДНК у молодых интактных крыс был достоверно ниже. Показано, что тестостерон защищает клетки от повреждений, вызванных окислительным стрессом [13]. В то же время окислительный стресс влияет на накопление гранул липофусцина и может индуцировать апоптоз в различных типах клеток [13]. Так, естественное падение уровня тестостерона с возрастом может вызвать увеличение апоптоза, что коррелирует с высоким содержанием внДНК в крови.

Не стоит оставлять без внимания, что у молодых крыс с ДГПЖ уровень внДНК был значительно ниже, чем у старых, при относительно равном уровне тестостерона. При этом вес тела и вес ПЖ у молодых крыс был практически в два раза меньше, чем у старых крыс. Таким образом, воздействие тестостерона на старых и молодых крыс при развитии ДГПЖ существенно различалось. Судя по уровню внДНК процессы клеточной гибели не изменялись значимо после действия тестостерона у молодых животных и увеличивались у старых. Вероятно, у молодых крыс тестостерон стимулирует пролиферативные процессы [14], тем самым частично компенсируя сопутствующие ДГПЖ нарушения [15].

Мы предполагаем, что повышение уровня внДНК у старых крыс связано с активацией апоптоза, сопровождающего рост ткани ПЖ, по сравнению с молодыми животными. С одной стороны, рост ткани ПЖ во время развития ДГПЖ у старых крыс, возможно, сопровождается активной секрецией небольших количеств ДНК [16], что затем приводит к значительному увеличению содержания внДНК путем индукции апоптоза, как показано in vitro и in vivo [17]. С другой стороны, повышенный уровень внДНК у старых крыс, связанный с повышенным апоптозом, в результате межклеточной передачи сигналов растворимыми факторами секреции, внеклеточными везикулами и макрофагами, вовлеченными в апоптоз, приводит к образованию ниши для пролиферации клеток, вызывая усиление роста ПЖ [18]. Возможно, что у старых крыс могут быть активированы другие процессы гибели клеток, например, пироптоз, который отличается от апоптоза, некроза или онкоза, фагоцитоза клеток и их остатков, а также NE-Tosis, который может не сопровождаться гибелью нейтрофилов [16].

ДГПЖ и рак ПЖ [19] представляют собой значительную проблему для стареющего мужского населения во всем мире, и, как ожидается, актуальность этой проблемы будет только расти ввиду увеличения средней продолжительности жизни. Тем не менее, диагностика как доброкачественных, так и злокачественных заболеваний ПЖ остается неспецифичной и субъективной, что требует дополнительных инструментальных исследований для подтверждения диагноза. Это не только накладывает свой отпечаток на качество жизни пациента и смертность, но и несет экономическое бремя для системы здравоохранения в целом. В частности, специфичность традиционного ПСА теста может варьировать от 30% до 70%, в большинстве случаев требует проведении биопсии и не способна дифференцировать ДГПЖ и рак ПЖ. Кроме того существуют сведения об увеличении хронического воспаления, эректильной дисфункции, развития синдрома нижних мочевых путей в результате повторных биопсий [20]. В сравнениис этим, по данным ряда исследователей, самая простая ПЦР диагностика внДНК, являясь неинвазивной техникой, позволяет добиться специфичности и чувствительности на уровне не менее 70% и способна взаимоисключать доброкачественные и злокачественные заболевания ПЖ [3,4].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Уровень внДНК у старых и молодых крыс существенно различался. При индукции ДГПЖ в эксперименте, судя по уровню внДНК, процессы клеточной гибели не изменялись значимо у молодых крыс, однако значительно увеличивались у старых животных. Аналогичная тенденция наблюдалась и в группе интактных животных, однако была достоверно ниже, чем при ДГПЖ. Таким образом, у стареющих животных внДНК отражала прогрессирование ДГПЖ от частичной атрофии тканей ПЖ к прогрессирующей гиперплазии, чему сопутствовали процессы апоптоза и повышение уровня внДНК в крови. Полученные данные свидетельствуют об усилении процессов апоптоза при развитии ДГПЖ вопреки росту тканей в самой ПЖ. Учитывая, что ДГПЖ относят к заболеваниям стареющих мужчин, полученные результаты подтверждают необходимость дальнейших исследований диагностической значимости внДНК как неинвазивного биомаркера, что позволит обеспечить пациентов персонализированной диагностикой и более точным лечением.

экспериментальная и клиническая урология № 3 2 0 19

ЛИТЕ РАТУPA/REFERENCE S

Сведения об авторах:

Вклад авторов:

И.Н. Васильева – написание текста публикации

В.Г. Беспалов – разработка дизайна исследования

А.Л. Семенов – получение и анализ статистических данных

Г.В. Точильников – написание литературного обзора

В.А. Романов – получение данных для анализа

В.А.Александров – подведение выводов, их написание