Восстановление нарушенного сперматогенеза после интратестикулярной трансплантации ткани неонатального яичка

экспериментальная и клиническая урология № 4 2 0 1 8

Метод трансплантации под белочную оболочку яичка был выбран в связи с иммунопривилегированностью этой зоны вследствие наличия гематотестикулярного барьера, что позволяет приживать генетически чужеродным тканям и клеткам. Методика трансплантации заключалась в надсечении белочной оболочки яичка в бессосудистой зоне, формировании с помощью микрохирургического зонда под белочной оболочкой тоннеля и помещении в него фрагмента неонатальной тестикулярной ткани с последующим ушиванием разреза оболочки яичка.

Животных обследовали через 1 и 3 месяца после низведения яичка. В эти сроки брали пробы крови для определения уровня тестостерона в крови, удаляли яички, определяли их массу взвешиванием и брали пробы ткани из области трансплантации для гистологического и морфометрического исследования. Концентрацию тестостерона в сыворотке крови определяли иммунохемилюминес-центным методом на иммунохимиче-ском анализаторе Access 2 (Beckman Coulter, США). Гистологическое исследование проводили по стандартной методике с окрашиванием парафиновых срезов гематоксилином и эозином.

Статистическую обработку цифровых данным проводили по методу Стьюдента с использованием критерия достоверности t. Статистически значимыми считали различия при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Во всех экспериментах через 2 недели после перемещения яичек в брюшную полость развивалась их выраженная гипотрофия. Масса органа уменьшалась с 1,87±0,03 г до 0,79±0,02 г (p<0,001). В контрольной серии (без трансплантации) через 1 и 3 месяца после низведения яичек в мошонку их масса возрастала незначительно, но статистически достоверно – до 0,92±0,03 и 0,96±0,03 г соответственно (p<0,05). В опытной серии (с трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани) через 1 и 3 месяца после низведения яичек во всех опытах выявили приживший трансплантат, размеры которого возрастали с увеличением сроков наблюдения (рис. 1).

Рис. 1. Внешний вид яичка крысы через 1 месяц (А) и через 3 месяца (Б) после трансплантации ткани неонатального тестикула под белочную оболочку. Стрелкой указан приживший трансплантат

При этом масса органа в опытной серии возрастала в большей степени, чем в контрольных опытах, приближаясь к нормальным значениям – до 1,26±0,02 и 1,59±0,03 г через 1 и 3 месяца, соответственно. Различия между контрольной и опытной группами оказались статистически значимыми с достоверностью p<0,001 (рис. 2).

Рис. 2. Влияние трансплантации неонатальной тестикулярной ткани на восстановление массы крипторхированного яичка крысы (в граммах). *** достоверность различий между группами p <0,001

Гистологическое исследование крипторхированных яичек выявило значительное нарушение сперматогенеза с появлением множества пол- ностью запустевших или склерозированных канальцев, а также канальцев с резко дистрофированным эпителием. После низведения яичек в мошонку в контрольной серии картина менялась незначительно. Даже через 3 месяца по-прежнему сохранялось большое количество канальцев, скле- розированных или полностью ли- шенных сперматогенного эпителия, а в канальцах с сохраненным эпителием выявляли только незрелые формы клеток (рис. 3).

Рис. 3. Гистологическая картина крипторхиро-ванных яичек перед низведением в мошонку (А) и через 3 месяца после низведения (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100х

При исследовании яичек опытной серии выявили, что в прижившем трансплантате уже через один месяц сформировались зрелые семенные канальцы, выстланные спер-матогенным эпителием разной степени зрелости. Дифференцировка клеток в канальцах доходила до стадии сперматоцитов 1-го порядка. В интерстициальной ткани трансплантата обнаружены кровеносные сосуды и скопления клеток Лейдига. Трансплантат окружен соединительнотканной капсулой, отграничивающий его от ткани яичка экспериментальная и клиническая реципиента (рис. 4). Через 3 месяца сохранялась такая же картина. Таким образом, пересаженная незрелая тестикулярная ткань подвергалась нормальному развитию с формированием типичных структур зрелого органа, но с незавершенным сперматогенезом.

Таблица 1. Морфометрические показатели крипторхированных яичек через 1 и 3 месяца после их низведения

Показатели	1 месяц		3 месяца
	Контроль	Опыт	Контроль	Опыт
Доля запустевших канальцев (%)	75,1±6,3	6,2±0,3***	69,8±5,1	3,2±0,2***
Кол-во клеток Сертоли на 1 каналец	3,3±0,7	34,6±2,2***	10,2±0,9	41,3±1,8
Кол-во клеток Лейдига на ед. площади препарата	1,6±0,6	41,1±3,6***	3,2±0,6	44,8±3,9***

Примечание: *** - различие по сравнению с контролем достоверно при p <0,001

Рис. 4. Трансплантат неонатальной тестикулярной ткани через 1 месяц после пересадки под белочную оболочку крипторхированного яичка.

А – общий вид трансплантата. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 50х

Б – семенные канальцы трансплантата, выстланные сперматогенным эпителием разной степени зрелости. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.200х

При этом обнаружили значительное улучшение состояния спер-

Рис. 5. Гистологическая картина крипторхиро-ванного яичка через 3 месяца после низведения в мошонку с одновременной трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400х матогенного эпителия в семенных канальцах собственного яичка реципиента. Значительно уменьшалось число запустевших канальцев по сравнению с контрольной серией. Большинство канальцев были выстланы сперматогенным эпителием, причем во многих канальцах выявлялся полностью завершенный сперматогенез (выявляли сперматозоиды в просвете канальцев) (рис. 5).

С целью большей объективизации изменений, вызванных трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани, провели количественный анализ ряда существенных показателей, характеризующих состояние крипторхированных яичек в опытной и контрольной сериях, а именно, количество запустевших канальцев на единицу площади препарата, число клеток Сертоли на 1 каналец, число клеток Лейдига на единицу площади препарата, а также наличие клеток сперматогенеза разной степени дифференцировки (табл. 1).

В контрольной серии доля полностью запустевших канальцев составила через 1 месяц после низведения 75,1±6,3%, а через 3 месяца -69,8±5,1%, тогда как в опытной серии (с трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани) их доля значительно уменьшилась, составив всего 6,2±0,3% и 3,2±0,2% соответственно ( p <0,001 по сравнению с контрольной серией).

Число клеток Сертоли на 1 каналец в контрольной серии составило в среднем 3,3±0,7 клеток через 1 месяц и 10,2±0,9 клеток через 3 месяца после низведения яичек, а в опытной серии этот показатель возрос до 34,6±2,2 и 41,3±1,8 клеток соответственно ( p <0,001 по сравнению с контрольной серией).

Число интерстициальных клеток Лейдига на единицу условной площади в контрольной серии составило 1,6±0,6 и 3,2±0,6 через 1 и 3 месяца после низведения яичек, тогда как в опытной серии этот показатель составил 41,1±3,6 и 44,8±3,9 клеток через 1 и 3 месяца соответственно ( p <0,001 по сравнению с контрольной серией).

Важным показателем состояния сперматогенеза является его завершенность, определяемая гистологически по выявлению клеток

Таблица 2. Влияние трансплантации неонатальной тестикулярной ткани на восстановление нарушенного сперматогенеза в крипторхированных яичках

Серии	Сперматогонии А светлые	Сперматогонии А темные	Сперматогонии Б	Сперматоциты 1 порядка	Сперматоциты 2 порядка	Сперматозоиды
Через 1 месяц
Контроль (1-я серия)	100%	60%	12,5%	12,5%	0	0
Опыт (2-я серия)	100%	100%	100%***	100%***	88%***	38%***
Через 3 месяца
Контроль (1-я серия)	100%	100%	63%	38%	13%	0
Опыт (2-я серия)	100%	100%	100%	100%***	100%***	75%***

Примечание: *** - различие по сравнению с контролем достоверно при p<0,001

экспериментальная и клиническая урология № 4 2 0 1 8 сперматогенного эпителия разной степени зрелости вплоть до сперматозоидов. Проведенный анализ показал, что в контрольной серии в подавляющем большинстве опытов в канальцах с сохраненным сперма-тогенным эпителием выявляли блок сперматогенеза на уровне спермато-гоний или сперматоцитов 1-го порядка (табл. 2). Через 1 месяц после низведения яичек лишь в 60% опытов в семенных канальцах выявляли темные сперматогонии А, а более зрелые формы (сперматогонии Б и сперматоциты 1-го порядка) были обнаружена в канальцах лишь в 1 из 8 опытов. Более зрелые формы не выявлялись ни в одном из опытов этой серии. Через 3 месяца картина несколько улучшилась (сперматого-нии А темные выявлены в канальцах в 100% случаев, сперматогонии Б – в 63% (5 из 8 опытов), сперматоциты 1-го порядка – в 38% (3 из 8 опытов), а сперматоциты 2-го порядка – в 13% (1 из 8 опытов). Сперматозоиды в просвете канальцев не выявлены ни в одном из экспериментов.

В то же время в опытной серии через 1 месяц после низведения яичек во всех опытах сперматогенез доходил до стадии сперматоцитов 1-го порядка, а в 38% (3 из 8 опытов) в просвете канальцев выявляли зрелые сперматозоиды. Через 3 месяца во всех опытах сперматогенез доходил до стадии сперматоцитов 2-го порядка, а в 75% (6 из 8 опытов) был полностью завершенным (в просвете канальцев выявляли сперматозоиды).

Поскольку мы выявили значительное восстановление популяции клеток Лейдига в крипторхирован-ном яичке после трансплантации неонатальной тестикулярной ткани, было важно определить их функциональную активность, а именно способность к синтезу тестостерона. Определение его концентрации в крови показало, что после 2 недель пребывания яичек в брюшной полости уровень тестостерона снижается почти в 2 раза (с 2,51±0,3

нг/мл до 1,32±0,3 нг/мл). В контрольной серии опытов через 1 и 3 месяца после низведения яичек в мошонку он достоверно не менялся, составив 1,44±0,4 и 1,48±0,3 нг/мл соответственно. В то же время в опытной серии уже через 1 месяц уровень тестостерона возрастал до 2,13±0,4 нг/мл, а через 3 месяца достигал нормальных значений (2,87±0,5 нг/мл).

Рис. 6. Влияние трансплантации неонатальной тестикулярной ткани на уровень тестостерона плазмы крови крыс с 2-недельным эксперимен- тально вызванным крипторхизмом.

*** различия достоверны при p <0,001 по сравнению с контрольной серией

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что трансплантация неонатальной тестикулярной ткани, полученной от новорожденных крысят (1-2 суток после рождения), взрослым крысам с нарушением сперматогенеза путем моделирования абдоминальной формы крипторхизма приводит к стимуляции регенерации поврежденных структур органа, включая клетки Сертоли, клетки Лейдига и сперматогенный эпителий. При этом происходит полное восстановление сперматогенеза до стадии сперматозоидов, чего не происходит в контрольных опытах, где трансплантация ткани не выполнялась.

В публикациях последних лет имеется много доказательств, что пересадка низкодифференцированных стволовых клеток внетестику-лярного происхождения, обладающих высокой пластичностью, в частности мезенхимных стволовых клеток костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика, приводит к восстановлению сперматогенеза, нарушенного различными методами [4,13-16]. При этом име- ются данные, что эти клетки способны трансформироваться в клетки Лейдига, продуцирующие тестостерон, с чем и связан их лечебный эффект [4,14]. Также описано положительное влияние трансплантации культивированных предшественников клеток Лейдига или стволовых клеток сперматогенного эпителия [2,3,5,17,18]. При этом также выявлено, что пересаженные в яичко сперматогонии могут трансформироваться в клетки Лейдига, секретирующие тестостерон [8], однако для этого необходима кооперация этих клеток с другими клетками их микроокружения. Если при трансплантации суспензии интерстициальной ткани, заключенной в альгинатные капсулы, в подкожную клетчатку кастрированных самцов крыс не выявляли достоверного возрастания уровня тестостерона в крови животных, то при совместной трансплантации интерстициальных клеток и семенных канальцев обнаружили формирование гормонально активных клеток Лейдига с нормализацией уровня тестостерона в крови. Авторы заключают, что интерстициальные клетки-предшественники нуждаются для дифференцировки в гормонально активные клетки в паракринных факторах, которые могут продуцироваться клетками семенных канальцев.

Именно такая ситуация имеет место в незрелых яичках плодов и новорожденных, где имеется полный набор клеток-предшественников всех структур развивающегося органа, что обеспечивает их кооперацию в условиях оптимального микроокружения («ниши»). Это предполагает, что трансплантация ткани плодных или неонатальных яичек может оказать не менее выраженный, а возможно, и более выраженные терапевтический эффект, чем при пересадке культивированных стволовых клеток какого-либо вида.

Наши эксперименты подтверждают это предположение. Транс- плантация ткани неонатального яичка под белочную оболочку поврежденного тестикула (2 недели абдоминального крипторхизма) практически полностью восстанавливала способность к секреции тестостерона и нормализовала сперматогенез вплоть до стадии сперматозоидов. Такой выраженный эффект обеспечивался также длительным сохранением жизнеспособности пересаженной ткани, несмотря на анти- генные различия трансплантата и реципиента (использовали аллогенный вариант трансплантации), что обеспечивалось, с одной стороны, наличием гематотестикулярного барьера, уменьшающего вероятность иммунного отторжения, а с другой стороны более низкой иммуногенностью незрелой тестикулярной ткани за счет низкой экспрессии антигенов гистосовместимости локуса МНС-1 и отсутствие антигенов локуса МНС-2 [19].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резюме:

В экспериментах на 20 белых беспородных крысах-самцах моделировали нарушение сперматогенеза путем перемещения обоих яичек в брюшную полость на 2 недели. После этого яички низводили в мошонку, причем в опытной серии при этом производили трансплантацию ткани яичка, полученной от новорожденных крысят (1-2 дня после рождения), под белочную оболочку. В контрольных опытах трансплантации не проводили.

При обследовании животных через 1 и 3 месяца в контрольных опытах выявили выраженную гипотрофию яичек (до 51% от нормы), резкое нарушение сперматогенеза, проявляющееся в блоке созревания клеток сперматогенного эпителия на уровне сперматогоний или сперматоцитов 1-го порядка, 3-4 кратное уменьшение количества клеток Сертоли и более чем 10-кратное уменьшение клеток Лейдига, а также почти двукратное снижение концентрации тестостерона в крови. В опытах с трансплантацией неонатальной тестикулярной ткани во всех экспериментах обнаружены прижившие трансплантаты, увеличивающие в размерах к 3 месяцам. При этом отмечали постепенное увеличение массы криптор-хированных яичек до 84% от нормы, полное восстановление сперматогенеза в большинстве канальцев (наличие сперматозоидов в просвете канальцев) и нормализацию уровня тестостерона в крови.

Считают, что выраженный терапевтический эффект трансплантации фрагментов неонатальной тестикулярной ткани связан с сохранением кооперации стволовых клеток, относящихся к различным органным структурам, в условиях оптимального микроокружения (ниши). Важным условием является длительное сохранение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток пересаженной ткани, обусловленное иммунопривилегированностью области пересадки (наличие гематотестикулярного барьера) и низкой иммуногенностью стволовых клеток.