Воздействие бактериального лектина и повышенной температуры на адипоциты

Чрезмерное накопление жировых отложений в теле, которое можно определить как ожирение [1-4], было и остается достаточно серьезной проблемой для здоровья человека. При таких заболеваниях, как диабет, гипертония, коронарная патология, гиперлипидемия и подагра, ожирение связано как с перераспределением жировой ткани, так и с увеличением её абсолютного количества [5, 6]. Объем жировой ткани зависит от числа и размера адипоцитов. Причем риск нарушения обмена веществ возрастает с увеличением размера адипоцитов. В организме повышается уровень свободных жирных кислот, что приводит к нарушению структуры мембраны адипоцитов, в результате происходит не только увеличение размера клеток, но и активный рост ткани. При заполнении жиром всех существующих адипоцитов до критической отметки клетки-предшественники начинают делиться и далее заполняться вновь образующимся жиром.

Одним из самых простых способов влияния на жировую ткань является ее нагрев. Известно, что нагрев жировой ткани выше нормального физиологического значения (43°-44 ^О С) способствует деградации жировых клеток [7]. Однако механизмы деградации и эффективность процесса изучены недостаточно.

Хорошо известно, что гибель части клеток в организме является закономерным и необходимым явлением, и само существование многоклеточного организма подразумевает баланс жизни и смерти на уровне составляющих его клеточных популяций. Программированная гибель или апоптоз – это активная форма гибели клетки, являющаяся результатом реализации ее генетической программы или

ответом на внешние воздействия и проявляющаяся в уменьшении размера клетки, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении клеточной стенки и цитоплазматической мембраны без выхода содержимого клетки в окружающую среду [8]. Апоптоз универсально распространен в мире многоклеточных организмов: аналогичные ему проявления описаны у дрожжей, трипаносом и некоторых других одноклеточных. Ему подвержены все виды тканей. Однако в подавляющем большинстве работ, посвященном апоптозу, объектом изучения являются лимфоциты млекопитающих, прежде всего тимоциты: они легко подвергаются апоптозу, их удобно культивировать, и они хорошо изучены. Именно поэтому классическая схема апоптоза соответствует апоптозу, наблюдаемому в лимфоцитах. Однако процесс апоптоза в других тканях не всегда протекает по классической схеме и имеет свои особенности. Апоптоз, наблюдаемый в кардиомиоцитах [9] или клетках нервной ткани [10], отличается от классической картины апоптоза.

Ранее, основываясь на гипотезе, высказанной в работе [7], при исследовании влияния температуры на жировые клетки человека нами показано, что процесс, подобный апоптозу происходит в жировой ткани под воздействием температуры [11]. Возможно, что эффект температуры можно усилить или, наоборот, ослабить, используя лектин, как биологически активное вещество, способное определенным образом влиять на мембрану клетки и ее метаболизм.

В литературе встречается достаточно большое количество примеров влияния лектинов на клетки животных. Так, лектин бактерий Pseudomonas aeruginosa дестабилизирует мембрану, снижает осмотическую стойкость эритроцитов [12]. Показано, что лектин зародышей пшеницы (АЗП) связывается с инсулиновыми рецепторами на поверхности жировых клеток и оказывает такое же воздействие на ее метаболизм как инсулин: увеличивает скорость окисления глюкозы, ингибирует липолиз, стимулируемый адреналином [13-16]. Таким же действием обладают лектин чечевицы и конканавалин А (Кон А). Оказалось, что Кон А, лектин с другой углево-дсвязывающей специфичностью, имитирует действие инсулина, причем это свойство проявляется не только по отношению к жировым клеткам, но и в случае с клетками печени [17], и мышечных волокон [18]. Кон А к тому же обусловливает увеличение проницаемости мембраны для ионов натрия; лектин фасоли, наоборот, вызывает увеличение поглощения ионов калия клеткой [19]. Обнаружено изменение фагоцитарной активности макрофагов при действии лектина ЛII Paenibacillus polymyxa 1460 на клетки иммунной системы [20]. Лектин Azospirillum brasilense Sp7, выделенный из непатогенных бактерий, обладает митогенными свойствами [21], оказывает влияние на синтез лимфоцитами провосполи-тельных цитокинов [22].

Целью нашего исследования явилось изучение влияния бактериального лектина (биологически активного вещества) и температуры на состояние клеток жировой ткани человека в норме и при патологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали подкожный жир человека из области брюшной полости и ягодиц. Образцы отбирались у практически здорового человека, с нормальной массой тела, здорового человека склонного к ожирению (СКО) (по определению ИМТ – индекс массы тела) [23] и человека больного диабетом СКО в возрасте 32-35 лет. Всего в эксперименте использовали биологический материал, полученный от 28 человек: – от 12 здоровых; – 7 больных сахарным диабетом и 9 – склонных к ожирению. Изучение изменений структуры жировых клеток под действием температуры проводили в экспериментах in vitro .

Эксперименты проводились на гистологических препаратах клеток подкожной жировой ткани поверхностного слоя, который состоит из плотных пакетов жира, заключенных в хорошо организованную фиброзную оболочку.

Экспериментальная установка состояла из микроскопа (МФН-11 NXA1951), цифрового фотоаппарата (Nikon coolpix 995), подключенного к персональному компьютеру и термостолика, на который помещались образцы [24].

Исследования выполнялись на жировых клетках человека, полученных в процессе хирургического вмешательства. После извлечения методом аутопсии жировая ткань помещалась в физиологический раствор (0,9% водный раствор NaCl с pH 6,8) и промывалась, а затем замораживалась при температуре минус 10ºС. С помощью микротома делали тонкие срезы толщиной 100-200 мкм и размером 1 х 1 см, которые затем нагревались до комнатной температуры 20-25ºС. Жировая ткань использовалась в течение первых 5 суток после изъятия. В результате экспериментального исследования и в соответствии с литературными данными было подобрано время хранения ткани [25]. Жизнеспособность изучаемых клеток фиксировали с помощью окраски 0,2%-ным раствором метиленового синего по методу [26, 27].

В растворе краски тонкий срез ткани выдерживался при комнатной температуре в течение 1-1½ часов. Следует подчеркнуть, что в тучных клетках соединительной ткани (адипоцитах), в спинном и головном мозге при прижизненной окраске не удается получить гранулярного отложения красителя [25]. Адипоциты окрашиваются диффузно, и обратимость паранекротических изменений проявляется при тщательном и длительном отмывании образца, благодаря его диффузии в окружающий раствор. При повторном окрашивании краситель также сначала окрашивает мембрану и только потом проникает в клетку. Повторяемость процесса свидетельствует о жизнеспособности клетки.

В работе был использован лектин бактерий штамма – Azospirillum brasilense Sp7. Штамм бактерий получен из Института микробиологии РАН (г. Москва). Культуры азоспирилл выращивали на жидкой синтетической среде для флоккуляции, предложенной Sadasivan и Neyra при 37⁰С в течение 18 ч [28]. Выделение лектина с поверхности клеток проводили методом Eshdat [29]. Очистку лектина осуществляли с помощью гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-75. В качестве элюентов использовали 0,1М СН₃СООН (рН 4,8) и 0.05М фосфатный буфер (рН 7,0) с 0,85М NaCl. Гомогенность очищенных лектинов определяли с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле с SDS. Белок определяли по методу Бредфорд [30]. Концентрация лектина составляла 10 и 35 мкг/мл.

Тонкие образцы ткани обрабатывали лектином и помещали во влажную воздушную среду на 30 мин. Затем образцы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS).

Полученные образцы ткани с жизнеспособными клетками помещали на термостолик, который фиксировался с помощью зажимов, на предметном столике микроскопа, и микроскопировали. В ходе наблюдений температура в образце поддерживалась постоянной в пределах физиологической гипертермии (43,5 ± 0,5)°C [31]. Микроскопическое исследование проводилось на 100 клетках в 15 экспериментах.

Основными параметрами, по которым судили о состоянии жировых клеток, были выбраны линейные размеры клеток (большой и малый) и площадь. Данный выбор обусловлен наглядностью и простотой способа наблюдения за изменениями, происходящими с клетками во время воздействия на них внешних факторов. Изображения, полученные с помощью цифровой камеры, переносились на персональный компьютер. Программное обеспечение для поддержки работы фотокамеры включало программу Capture Fly Video’98 для управления камерой в среде Windows 98 или Windows 2000. Запись файлов изображений на диск осуществлялась в формате AVI (Windows Media). Затем полученные файлы переводились в один из следующих форматов: BMP, JPEG.

Во время нагрева образца, фотографии делались через определённые промежутки времени – 2-4 минуты. Наблюдения велись непрерывно за одними и теми же клетками. С помощью программ для обра- ботки растровых изображений Microsoft Photo Editor, Adobe Photoshop из пакета Microsoft Office 2000 и Origin из пакета Origin Lab вычислялись значения размеров выбранной клетки в пикселях по всем элементам изображения. Необходимо отметить, что измерения размеров клетки проводились с погрешностью разрешения монитора (3,7 точек/мм). Калибровка результатов измерений геометрических характеристик образцов осуществлялась по стандартной методике с использованием объект – микрометра проходящего света (ОМ-П).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При сравнении воздействия температуры на динамику гибели адипоцитов практически здоровых людей и людей склонных к ожирению, было установлено, что время гибели клеток жировой ткани людей склонных к ожирению увеличивается вдвое по сравнению с клетками практически здоровых людей, погибающих в течение 60-70 мин [11, 32]. Воздействие лектина на жировую ткань предполагало его влияние на время разрушения адипоцитов. Сравнение результатов действия температуры, а также температуры и лектина на клетки жировой ткани здорового человека склонного к ожирению и человека, больного диабетом и склонного к ожирению, выявило, различия во времени гибели клеток.

Гибель клеток, наблюдаемая при микроскопическом исследовании (рис. 1), определялась по отсутствию светящегося ободка клеточной стенки. Это связано с дифракцией и многократным внутренним отражением между границами двух прилегающих и отличающихся по преломлению сред жировой капли и межклеточной жидкости. При нарушении равенства показателей преломления клетки и среды видимость клеточной стенки ухудшается и полностью исчезает, когда показатели преломления среды и клеточной стенки становятся равными. Из этого можно предположить, что клетка распалась (погибла) и ее содержание перемешалось с межклеточной жидкостью, уравнивая тем самым показатели пре- ломления. Окрашивание образца по окончанию эксперимента витальным красителем не выявило никаких клеточных структур. Все вышеперечисленные эффекты наблюдались в последние 10-20 минут эксперимента.

На рис . 2 и 3 представлены измеренные и рассчитанные геометрические характеристики адипоцитов людей больных диабетом и склонных к ожирению и людей здоровых, склонных к ожирению, обработанные лектином различной концентрации и подвергнутые нагреву. Время инкубации в растворе лектина составляло 30 мин. В эксперименте использовали две концентрации лектина – 10 и 35 мкг/мл. Контролем служили клетки жировой ткани, подвергнутые действию температуры и клетки, подвергнутые только действию лектина. Гистологические срезы жировой ткани при воздействии температуры и лектина представлены на фотографиях (рис. 1). Исследования показали, что под действием температуры гибель жировых клеток здоровых людей склонных к ожирению происходила за 120-130 мин (рис. 2а). Время гибели жировых клеток предварительно обработанных лектином и затем подвергнутых действию температуры составляло 45-60 мин (рис. 2б).

Клетки жировой ткани человека больного диабетом склонного к ожирению под действием температуры гибли в течение 200-240 мин. (рис. 3). Однако совместное воздействие лектина и температуры на адипоциты уменьшало срок существования клеток до 140 мин. и 155 мин. при концентрации лектина 35 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно (рис. 3).

Связывание лектинов с мембраной вызывает целый ряд изменений в молекулярной организации мембраны и ее функции. Воздействие лектина может вызвать повышение проницаемости мембраны для ионов К+ и Са2+; увеличение текучести мембраны и усиление фосфорилирования мембранных белков [12]. Возможно, изменение данных физических характеристик клеточной мембраны и обуславливает различие действия лектина и температуры, и только температуры на адипоциты.

а

б)

122 минуты нагрева

в)

г) 50 минут нагрева

е) 145 минут нагрева

д)

Рис. 1. Гистологические срезы жировой ткани людей СКО при воздействии температуры и лектина: а, в, д – до нагрева; б, г, е – после нагрева в течение 122, 50 и 145 мин., соответственно; а, б – здорового человека СКО под воздействием температуры; в, г – здорового человека СКО под воздействием температуры и лектина; д, е – больного диабетом СКО под воздействием температуры и лектина

а)

б)

Рис. 2. Временная зависимость размера жировых клеток здоровых людей СКО в возрасте 32 и 34 лет при температурном воздействии без лектина (а) и с лектином, в концентрациях 10 и 35 мкг/мл (б). Биопсия бралась у двух пациентов СКО из брюшной области: а) кривая 1 – M±m = 101,27±0,98; кривая 2 – M±m = 119,44±1,11; б) кривая 1 – усреднение по 32 клеткам, конц. лектина 35 мкг/мл; кривая 2 – усреднение по 47 клеткам, конц. лектина 10 мкг/мл (0,02

Сравнение результатов совместного воздействия лектина (10 мкг/мл) и температуры на жировую ткань здорового человека, склонного к ожирению и человека, больного сахарным диабетом склонного к ожирению, показало различие во времени гибели клеток в 100 мин. (Рис. 2б, 3).

При увеличении концентрации лектина с 10 до 35 мкг/мл разрушение жировых клеток происходило быстрее на 15-20 минут. Необходимо отметить, что разница во времени гибели клеток разных размеров, но при воздействии одной и той же концентрации лектина, составляет, примерно, 2-4 мин. В условиях комнатной температуры 20-25°С лектин не оказывал влияния на морфологию контрольного образца жировой ткани.

Воздействие лектина и температуры на жировые клетки сравнивали с действием на них только температуры. Одновременно было изучено действие на адипоциты нейтрального белка – бычьего сывороточного альбумина (BSA) в концентрации 10, 35 и 70 мкг/мл. Как показали исследования, BSA в данных концентрациях не оказывал никакого влияния на процесс гибели клеток, как при комнатной, так и при повышенной температуре.

Предварительная обработка жировой ткани бактериальным лектином усиливала действие темпера- туры на клетки жировой ткани как здорового человека склонного к ожирению, так и человека больного сахарным диабетом склонного к ожирению. Обнаружены различия во времени гибели адипоцитов при воздействии температуры и в присутствии лектина в зависимости от физиологического состояния ткани.

Установлено, что клетки жировой ткани, подвергнутые нагреву и предварительной обработке лектином, по сравнению с контрольными образцами ткани, не подвергавшимися нагреву, обработанными только лектином или BSA заметно уменьшаются в размере, а затем и погибают.

Таким образом, показано, что воздействие лектина на мембрану клетки в совокупности с повышенной температурой активирует механизм клеточной гибели. Величина скорости развития наблюдаемого процесса в клетке, уменьшение размеров клетки, отсутствие нарушения целостности мембраны (до определенного момента) дают основание предположить, что мы наблюдали в жировой ткани процесс подобный процессу апоптоза.

Проведенные исследования позволяют оптимизировать термохимические методы редукции подкожной жировой клетчатки, а также, возможно, могут быть использованы, в диагностике заболевания инсулинозависимым сахарным диабетом и выявлении предрасположенности к нему

Время нагрева, мин

Рис. 3. Временная зависимость размера жировых клеток человека СКО больного сахарным диабетом в возрасте 35 лет при температурном воздействии с лектином, в концентрации 10 и 35 мкг/мл, и без него. Биопсия бралась у пациента СКО больного сахарным диабетом из области ягодиц: кривая 1 – усреднение по 40 клеткам, конц. лектина 35 мкг/мл (0,02 < р <0,05); кривая 2 – усреднение по 58 клеткам, конц. лектина 10 мкг/мл (0,02<р<0,05); кривая 3 – без воздействия лектина, только нагрев, M±m = 116,67±1,12 (0,02