Возможности иммунопотенциометрии в диагностике лейкоза крупного рогатого скота

В диагностике инфекционных заболеваний и для выяснения эпизоотической ситуации в мировой практике широко применяются различные экспресс технологии. Особенно широкое распространение нашло это направление с развитием нанобиотехнологии. Экспресс-диагностика инфекционных заболеваний развивается в нескольких перспективных направлениях, таких как: иммуноферментное, иммунофизическое, иммунохимическое и др. [2]. Каждое направление подразделяется на отдельные группы методов и технологий. Например, иммунохимическим и иммунофизическим направлениям можно отнести наиболее бурно развивающиеся технологии – электрохимические, в основе которых лежит главным образом, применение иммуносенсоров.

Современные электрохимические методы иммуноанализа объединяют чувствительность электрохимического детектора и высокую специфичность реакции взаимодействия антиген-антитело. Электрохимические сенсоры подразделяются на две основные группы: амперометрические и потенциометрические. В амперометрических методах измеряется сила тока, как результат реакции, инициированной потенциалом измерительного электрода. В потенциометрических – мембранный или электродный потенциал, которые устанавливаются на границе раздела сенсор-раствор. В каждой из этих групп методов можно выделить несколько направлений. В потенциометрическом иммуноанализе, например, наиболее известным и широко применяемым является прямое определение степени связывания белков.

Прямое определение степени взаимодействия антигенов и антител считается наиболее целесообразным, так как при этом отпадает, во-первых, необходимость введения метки и, во-вторых, использования дополнительного измерительного оборудования. Как известно, белки – амфотерные высокомолекулярные соединения и поэтому в водном растворе частицы белка приобретают определенный электрический заряд. Качественные и количественные показатели этого заряда зависят, прежде всего, от рН среды и ионной силы раствора. В изоэлектрическом состоянии частицы белка в растворе могут коагулировать с образованием комплексов, что приводит к изменению физико-химических параметров системы, в том числе и электропроводности.

Такая особенность в поведении белка в растворе была применена впервые Джанатой для определения дрожжевого маннана при взаимодействии конканавалином А, иммобилизованным на покрытой поливинил хлоридом проволоке. В настоящее время известны множество способов диагностики патологических состояний живого организма, основанные на выявлении иммунокомплексов режиме амперометрии или потенциометрии в растворе [7], а также на поверхности электрода [4].

Однако применение потенциометрических датчиков, модифицированных антителами или антигенами, для непосредственного определения в растворах иммунохимически активных макромолекул показало, что такие системы имеют низкую чувствительность и специфичность [6]. Кроме того, используемые в настоящее время в иммунологии электрохимические методы определения патологических состояний, требуют, во-первых, сложного и дорогостоящего оборудования, во-вторых, антитела, конъюгированные с ферментом или ионами металлов, для использования в качестве метки.

Электрохимические способы выявления молекул в растворах высокомолекулярных соединений, антигенов и антител в биологических жидкостях, основанные на регистрации изменений показателей электропроводности и электродного потенциала при образовании комплексов, являются наиболее перспективными. Целью настоящей работы было обнаружение потенциометрических изменений проб сывороток крови в иммунологических реакциях.

Материал и методы исследований. В работе использовали сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ; положительные и отрицательные контрольные сыворотки коммерческих наборов по определению антител к ВЛКРС методом ИФА; антиген вируса лейкоза для ветеринарного применения производства ФГУП «Курская биофабрика»; буферные растворы и реактивы для постановки ИФА. В качестве электрода использовали реконструированный индикаторный электрод для рН метрии и определяли показатели ЭДС с помощью рН метра в режиме mV в сыворотке крови до и после внесения антигенов. При этом, в лунки иммунологического полистиролового планшета для серологических реакций вносили 0,5 мл исследуемой сыворотки крови, измеряли потенциал индикаторного электрода, добавляли 10 мкл антигена ВЛКРС и вновь определяли электродный потенциал.

Результат исследований.

Постоянным и характерным признаком инфицированности животных при лейкозе крупного рогатого скота является наличие антител к антигену ВЛКРС. Общепринятые в ветеринарной практике методы диагностики этой инфекции основаны на их обнаружении [1]. При взаимодействии антител со специфическими антигенами образуются иммунные комплексы, которые могут свободно циркулировать в сыворотке крови, а также появляться в биологических жидкостях. Аналогичное взаимодействие будет происходит и в условиях «in vitro».

Нами установлено, что существует значительная разница в потенциалах индикаторного электрода в пробах сыворотки крови от здоровых и инфицированных ВЛКРС животных до и после образования ЦИК «in vitro». Также проведено сравнительное изучение изменений потенциала электрода в таких же условиях после введения изменений в его конструкцию. Изменения в конструкции индикаторного электрода произведены с целью повышения его чувствительности и уменьшения размеров измерительной ячейки. Результаты исследований показали, что изменения потенциала фиксируются в достаточно больших пределах, значительно превышающих погрешность измерений.

Всего исследовано более 300 проб сывороток крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ. Уровень инфицированности животных вирусом лейкоза определяли методом ИФА. Около 50 % исследованных коров были инфицированные с ВЛКРС. Результаты исследований двадцати проб приведены в таблице 1.

Из результатов, приведенных в таблице, видно, что потенциометрические показатели сывороток крови здоровых коров после добавления антигена ВЛКРС меняются не более чем на 0,05 единиц, а у проб сывороток крови от инфицированных вирусом коров – на 0,15 и более единиц. Также нужно отметить, что электродный потенциал проб от инфицированных с ВЛКРС коров изначально выше на 0,030,06 единиц. Этот факт можно объяснить тем, что ВЛКРС инфекция сопровождается появлением в сыворотке крови иммунных комплексов, и, как известно, динамика и спектр сывороточных антител и иммунных комплексов зависят от стадии развития инфекционного процесса и индивидуальных особенностей организма животного [3].

Таблица 1 – Показатели потенциометрии сывороток крови

№ п/п Результат ИФА Электродный потенциал, mV до образования ЦИК после образования ЦИК 1 Отр. 0,31±0,070 0,35±0,075 2 Отр. 0,29±0,068 0,33±0,072 3 Отр. 0,30±0,069 0,34±0,072 4 Отр. 0,31±0,070 0,36±0,075 5 Отр. 0,31±0,070 0,35±0,073 6 Отр. 0,32±0,072 0,35±0,074 7 Отр. 0,30±0,071 0,33±0,072 8 Отр. 0,32±0,072 0,35±0,076 9 Отр. 0,31±0,070 0,33±0,073 10 Отр. 0,31±0,070 0,35±0,074 11 Полож. 0,33±0,072 0,48±0,081 12 Полож. 0,34±0,074 0,50±0,083 13 Полож. 0,31±0,072 0,51±0,083 14 Полож. 0,33±0,074 0,53±0,085 15 Полож. 0,35±0,075 0,50±0,080 16 Полож. 0,34±0,075 0,52±0,082 17 Полож. 0,33±0,074 0,52±0,082 18 Полож. 0,35±0,076 0,50±0,081 19 Полож. 0,36±0,074 0,53±0,084 20 Полож. 0,33±0,073 0,53±0,083 р<0,005

Заключение. Измерение потенциала индикаторного электрода в исследуемой пробе сыворотки крови до и после образования иммунных комплексов может служить основой для диагностических исследований при лейкозе крупного рогатого скота и других инфекционных болезней.

Доказана возможность использования потенциометрии для экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Преимуществом предлагаемого метода от других экспресс-тестов является возможность автоматизации процесса.

Прямое определение степени связывания антигенов потенциометрическим методом представляется вполне перспективным и целесообразным, так как является наиболее простым, достаточно точным и экономически оправданным.

Резюме

В статье описываются результаты исследований по определению разницы в электрохимических потенциалах индикаторного электрода в пробах сыворотки крови от здоровых и инфицированных ВЛКРС животных до и после образования ЦИК «in vitro». Потенциометрические показатели сывороток крови у здоровых коров после добавления антигена ВЛКРС меняются не более чем на 0,05 единиц, а у проб сывороток крови от инфицированных вирусом коров – на 0,15 и более единиц. Измерение потенциала индикаторного электрода в исследуемой пробе сыворотки крови до и после образования иммунных комплексов может служить основой для диагностических исследований при лейкозе крупного рогатого скота и других инфекционных болезней.